抗生素抗性基因在生活及工業(yè)混合廢水處理系統(tǒng)中的分布和去除

姚鵬城，陳嘉瑜，張永明，溫東輝，陳呂軍,*

1. 上海師范大學(xué)環(huán)境與地理科學(xué)學(xué)院，上海 200234 2. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100084 3. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871

自1929年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素至今，抗生素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用，然而日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題，成為21世紀(jì)威脅人類健康的重要因素之一[1]。在國(guó)際上，抗生素和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)已經(jīng)被認(rèn)為是新興的環(huán)境污染物[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年中國(guó)抗生素年使用量達(dá)到16.2萬(wàn)t，約占世界用量的1/2，同年約有超過(guò)5萬(wàn)t抗生素被排放進(jìn)入環(huán)境[3]。研究表明，受人類活動(dòng)影響的環(huán)境表現(xiàn)出更高豐度的抗生素抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)和ARGs[4]。目前大量研究表明ARGs廣泛存在于自然水土環(huán)境中[5]，如河流[6-8]、湖泊[9]、土壤[10]乃至海洋[11-12]。污水處理廠(wastewater treatment plants, WWTPs)匯集了人類生活、生產(chǎn)中的大量污水[13]，其污水、污泥被認(rèn)為是環(huán)境中抗生素抗性基因的主要人為污染源[14-16]，并且污水中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和大量的微生物為ARGs的增殖和傳遞提供了便利條件[17]。由于廢水處理工藝的不同，ARGs的分布受到影響，去除效果也各不相同[16,18-19]。以往的研究主要集中在進(jìn)水和出水上，缺乏分析處理生活及工業(yè)混合污水的不同工藝對(duì)ARGs分布的影響[20-21]，近年來(lái)污水處理不同工藝對(duì)ARGs分布影響的研究不斷增多[5,19]。為了更好地評(píng)價(jià)廢水處理系統(tǒng)中不同工藝去除ARGs的效果，強(qiáng)化ARGs的去除，降低ARGs釋放進(jìn)入環(huán)境，近年來(lái)考察廢水處理系統(tǒng)不同工藝對(duì)ARGs的作用及去除成為研究焦點(diǎn)[22-23]。

本研究選擇浙江某污水處理廠為研究對(duì)象，該廠進(jìn)水中生活污水占30%，工業(yè)廢水占70%，主要為化工、印染和造紙等廢水。選取廠內(nèi)2套不同的處理工藝，沿各工藝流程采集污水及泥水混合物，對(duì)其中8類共24種ARGs進(jìn)行定性檢測(cè)，并對(duì)其中7種ARGs、一類整合子及16S rDNA進(jìn)行定量檢測(cè)，分析ARGs在2套工藝流程中的分布特征以及對(duì)比2套工藝對(duì)ARGs的去除效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集及預(yù)處理

樣品采集于2018年4月，該污水處理廠的2套工藝流程、采樣點(diǎn)如圖1所示，圖1(a)為工藝一(P1)的流程，處理水量15萬(wàn)m3·d-1，主要技術(shù)為厭氧-缺氧-好氧處理(A2/O)和膜生物反應(yīng)器(MBR)；圖1(b)為工藝二(P2)的流程，處理水量30萬(wàn)m3·d-1，主要技術(shù)為氧化溝和二沉池。

采樣點(diǎn)包括：進(jìn)水(1-Inf和2-Inf)、MBR出水(1-Eff)、二沉池出水(2-Eff)、生物處理單元不同區(qū)段的泥水混合物(1-An、1-Ax、1-Ox和2-An、2-Ax、2-Ox)，以及二沉池剩余污泥(2-WS)。每個(gè)采樣點(diǎn)采集了1 L樣品，水樣存放于預(yù)先清洗干凈的無(wú)菌聚乙烯塑料瓶中，泥樣存放于預(yù)先清洗干凈的鋁盒中，冷藏運(yùn)輸，回到實(shí)驗(yàn)室后水樣置于4 ℃保存，泥樣置于-20 ℃保存。

1.2 樣品DNA提取

以0.22 μm混合纖維素酯濾膜(Millipore，德國(guó))過(guò)濾樣品，再使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mo Bio，美國(guó))試劑盒對(duì)濾樣提取DNA。使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳(DYCP-31DN，北京六一)和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))對(duì)所提DNA純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 PCR檢測(cè)

圖1 廢水處理系統(tǒng)2套工藝流程和采樣點(diǎn)示意圖Fig. 1 Two treatment processes and sampling points of the wastewater treatment plant

1.4 定量PCR(qPCR)檢測(cè)

根據(jù)PCR定性檢測(cè)的結(jié)果，本研究對(duì)tetC、tetW、sulΙ、sulⅡ、dfrA1、dfrA13和floR共7種ARGs、一類整合子intI1及16S rDNA進(jìn)行定量測(cè)定。采用SYBR Green I方法，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BioRad CFX96 Touch，美國(guó))對(duì)各目標(biāo)基因進(jìn)行定量測(cè)定。qPCR采用20 μL體系，包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，中國(guó))，引物各0.4 μL，DNA模板1 μL及ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1～2 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)[5]。溶解曲線程序?yàn)?5～95 ℃，每0.5 ℃讀數(shù)一次，期間停留30 s。測(cè)定時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以10倍梯度稀釋，再根據(jù)質(zhì)粒濃度計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)，與通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定得到的Ct值，可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建方法參照張衍等[24]的研究。各目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)在0.990～0.996之間。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行樣。

2 結(jié)果(Results)

2.1 進(jìn)水中的ARGs

2.2 污水處理廠2套工藝中ARGs的分布特征

根據(jù)表1的結(jié)果，對(duì)全部樣品中7種ARGs及intI1、16S rDNA進(jìn)行定量分析。進(jìn)水中目標(biāo)基因的分析結(jié)果如圖2所示。

該污水處理廠P1與P2進(jìn)水中ARGs的絕對(duì)豐度處于同一水平，說(shuō)明在P1與P2進(jìn)水中的ARGs對(duì)總ARGs的貢獻(xiàn)是相同的。絕對(duì)豐度最高的為intI1，P1、P2進(jìn)水中intI1的絕對(duì)豐度為1.88×106、7.76×105copies·mL-1，intI1在污水中較穩(wěn)定[27]，而后絕對(duì)豐度依次遞減的是sulⅠ、tetC、sulⅡ、tetW、dfrA1、floR和dfrA13，這些ARGs的絕對(duì)豐度為8.15×103～9.84×105copies·mL-1。與其他多次出現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道中的抗性基因不同，甲氧芐啶類抗性基因鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，dfrA1、dfrA13在2套工藝流程中均被檢出，表明現(xiàn)階段對(duì)污水處理廠ARGs分布狀況的評(píng)估有待改進(jìn)。

2套工藝中目標(biāo)基因沿處理流程的變化情況如圖3所示。在樣品中，16S rDNA的絕對(duì)豐度為1.74×104～3.0×108copies·mL-1，在A2/O工藝段和氧化溝工藝段樣品中16S rDNA的絕對(duì)豐度均高于進(jìn)水與出水的絕對(duì)豐度，說(shuō)明了微生物在生物處理單元得到了大量增殖，且在其后得到了有效分離[5]。

同時(shí)在該廢水處理系統(tǒng)的剩余污泥(2-WS)中，也檢測(cè)了各ARGs的分布狀況，如圖4所示，剩余污泥中各ARGs中磺胺類抗性基因絕對(duì)豐度最高，sulΙ、sulⅡ分別達(dá)到了1.79×108、9.96×107copies·g-1，然后依次為tetW、tetC、dfrA1、floR和dfrA13，絕對(duì)豐度分別為3.41×107、7.03×106、9.38×105、1.59×105和5.93×104copies·g-1，與進(jìn)水中的ARGs相比，剩余污泥中的ARGs絕對(duì)豐度要高得多。有報(bào)道指出，WWTPs污泥中ARGs的分布在105.69～1011.32copies·g-1絕對(duì)豐度水平[28]。在生物處理過(guò)程(A2/O、氧化溝)中去除ARGs，是由于活性污泥的吸附及其沉淀[29]，導(dǎo)致ARGs在剩余污泥中不斷的積累，致使剩余污泥中的ARGs絕對(duì)豐度高于進(jìn)水中ARGs的絕對(duì)豐度。目前中國(guó)大部分污水處理系統(tǒng)的剩余污泥通過(guò)脫水填埋處理，而剩余污泥中大量ARGs通過(guò)滲濾液釋放到泥土中，如果沒(méi)有妥善處理這些污泥的方法，勢(shì)必導(dǎo)致抗生素耐藥性基因向環(huán)境快速遷移和擴(kuò)散。有文獻(xiàn)報(bào)道，剩余污泥對(duì)環(huán)境中ARGs的釋放比污水貢獻(xiàn)更大[15]。

2.3 污水處理系統(tǒng)中2套工藝對(duì)ARGs的去除效果

如圖5所示，P1處理效果明顯優(yōu)于P2處理效果，其中，在P1中去除效果最佳的是四環(huán)素類tetC和tetW，去除效果達(dá)到3.88和3.86個(gè)數(shù)量級(jí)，而去除效果最差的是dfrA1，絕對(duì)豐度僅下降2.03個(gè)數(shù)量級(jí)，與P2的去除效果一致。而P1與P2的區(qū)別在于P1工藝有MBR工藝分離泥水混合物，P2工藝是二沉池通過(guò)重力作用分離泥水混合物，結(jié)果表明，MBR工藝對(duì)污水中大部分AGRs去除效果均好于二沉池工藝對(duì)ARGs的去除。從圖5可知，P2去除ARGs的效率依次為tetW、dfrA1、dfrA13、floR、tetC、sulΙ和sulⅡ，研究表明，磺胺甲惡唑耐藥菌難以去除[29]，這解釋了去除磺胺類抗性基因效果不佳的原因。

圖2 2套工藝進(jìn)水中的目標(biāo)基因絕對(duì)豐度Fig. 2 Absolute abundances of target genes in the two influents

圖3 2套廢水處理系統(tǒng)中ARGs和16S rDNA的分布Fig. 3 Abundance of ARGs and 16S rDNA in the two treatment processes

3 討論(Discussion)

研究發(fā)現(xiàn)，該污水廠的2套工藝中，污水從沉砂池進(jìn)入?yún)捬醭鼗蜓趸瘻系膮捬鯀^(qū)時(shí)，tetC和tetW基因絕對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，dfrA13和floR抗性基因絕對(duì)豐度顯著下降，分別下降了1.34和1.12個(gè)數(shù)量級(jí)?；前奉惪剐曰?sulΙ、sulⅡ)絕對(duì)豐度呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(shì)，而后抗性基因的絕對(duì)豐度趨于穩(wěn)定。16S rDNA基因的絕對(duì)豐度與磺胺類抗性基因絕對(duì)豐度的分布規(guī)律相似。在污水處理系統(tǒng)中，一類整合子和磺胺類抗性基因絕對(duì)豐度高于其他類抗性基因[28]，由于sulΙ、sulⅡ等磺胺類ARGs位于可傳遞單位(如intI1)上，磺胺類抗性基因具有很大的轉(zhuǎn)移能力[5]，而tetW為編碼核糖體保護(hù)蛋白的四環(huán)素類ARGs，不利于傳遞、轉(zhuǎn)移。

圖4 剩余污泥中ARGs絕對(duì)豐度分布Fig. 4 Abundance distribution of ARGs in sludge

圖5 2套工藝對(duì)ARGs、intI1和16S rDNA的去除(以基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)計(jì))Fig. 5 Removals of ARGs, intI1 and 16S rDNA by the two processes (Logarithm of gene copy number)

表1 廢水處理廠2套工藝進(jìn)水中抗生素抗性基因(ARGs)檢出情況Table 1 Presence of antibiotic resistance bacteria (ARGs) in the influents of the two processes in the wastewater treatment plant (WWTP)

注：+表示檢出，-表示未檢出；*表示定量檢測(cè)ARGs。

Note: + means check out; - means not detected;*means quantitative detection of ARGs.

P1工藝進(jìn)水(總ARGs為3.89×106copies·mL-1)到出水(總ARGs為2.56×103copies·mL-1)的總ARGs的絕對(duì)豐度顯著下降，P2工藝進(jìn)水(總ARGs為1.77×106copies·mL-1)到出水(總ARGs為6.67×104copies·mL-1)的總ARGs的絕對(duì)豐度下降程度比P1工藝小，表明P1工藝對(duì)ARGs的去除效果比P2工藝好。

該污水處理廠的P1工藝與P2工藝的出水合并，共同排入臨近海域。而P2的出水ARGs絕對(duì)豐度則比P1出水中的ARGs絕對(duì)豐度高1.34～1.90個(gè)數(shù)量級(jí)，結(jié)合P1、P2工藝的處理量，得出P2工藝中ARGs的排放通量分別為tetC(2.07×1015copies·d-1)、floR(6.67×1013copies·d-1)、dfrA13(1.31×1013copies·d-1)、sulⅡ(1.94×1015copies·d-1)、tetW(1.37×1014copies·d-1)、sulΙ(5.18×1015copies·d-1)和dfrA1(5.84×1013copies·d-1)，P2工藝ARGs的排放通量對(duì)總排水ARGs的排放通量的貢獻(xiàn)分別是tetC(98.7%)、floR(97.2%)、dfrA13(96.5%)、sulⅡ(96.1%)、tetW(95.8%)、sulΙ(95.6%)和dfrA1(43.5%)，說(shuō)明前6種基因P2出水對(duì)總出水的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于P1出水對(duì)總出水的貢獻(xiàn)。但是dfrA1基因在2套工藝中最終出水ARGs的排放通量一致，說(shuō)明2套工藝中dfrA1基因?qū)ψ罱K出水中dfrA1基因排放通量的貢獻(xiàn)是一致的。

傳統(tǒng)的活性污泥法去除ARGs以及intI1的主要途徑是活性污泥吸附水中的ARGs，而后通過(guò)固液分離去除，與傳統(tǒng)的活性污泥法相比，MBR工藝能更有效地降低ARGs。傳統(tǒng)工藝A2/O、厭氧好氧工藝法(A/O)和氧化溝的去除效果均沒(méi)有MBR工藝好[30]。在本研究中，只考慮細(xì)胞內(nèi)ARGs的基礎(chǔ)上，MBR工藝能捕獲水中所有直徑0.22 μm以上的懸浮顆粒，去除水中的ARGs，但MBR出水中依然可以檢測(cè)到所有種類的ARGs，這可能是由于固液分離不完全造成的，比如膜組件中纖維的斷裂等[31-32]。本研究中，P1為A2/O工藝和MBR工藝，P2為氧化溝工藝，2套工藝對(duì)ARGs的去除效果與文獻(xiàn)結(jié)果一致。絕對(duì)豐度高的ARGs(sulΙ、tetC、sulⅡ和tetW)在MBR工藝中與16S rRNA呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P<0.01)，高豐度的ARGs與微生物量密切相關(guān)，說(shuō)明固液分離是去除ARGs的主要途徑之一。不同工藝最終致使固液分離的程度不同，MBR工藝的固液分離效果遠(yuǎn)優(yōu)于二沉池的重力沉降，所以MBR工藝對(duì)ARGs的去除效果優(yōu)于氧化溝。但是dfrA1基因的去除效果在不同固液分離程度的工藝中并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的差別，有待深入研究。

污水處理廠的最終出水排入臨近海域，可能引起ARGs的傳播，影響海域內(nèi)的生態(tài)[5]。此外，無(wú)論是MBR工藝還是氧化溝工藝，ARGs通過(guò)活性污泥吸附，固液分離而被去除，但卻在污泥中富集。為徹底將ARGs去除，需在污水處理和污泥處置兩方面探索新技術(shù)和工藝，控制ARGs的產(chǎn)生和傳播風(fēng)險(xiǎn)。