miR-138-5p靶向HIF-1α影響人白血病K562細胞增殖和侵襲轉移

郭 濤,紀冬梅,李艷平,盧 陽,弋 莉,王曉紅 (朝陽市中心醫(yī)院血液內科,遼寧 朝陽 122000)

白血病以骨髓中造血干細胞無限增殖為特點,除急性粒細胞和急性淋巴細胞白血病之外,慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是最常見的白血病種類,是由粒細胞系造血干細胞的惡性增殖所致[1-4]。目前,CML的主要治療途徑是BCR/ABL融合蛋白靶向藥物聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑,但只在慢性期有效,對于急性期BCR/ABL融合蛋白陽性病例療效欠佳[5-6]。此外,化療藥物通常缺乏腫瘤特異性,化療藥物或酪氨酸激酶抑制劑的長期使用還會導致腫瘤細胞產生耐藥性[7]。因此,探索新的CML治療方法對提高療效、減輕副作用具有重要意義。MicroRNAs(miR)是一種內源性非編碼小分子RNA,存在于所有真核細胞中,長度約為22個核苷酸,參與調控細胞生長、增殖、凋亡和遷移等過程,在機體中扮演著十分重要的角色。研究表明,miR的異常表達常與多種疾病發(fā)展進程密切相關,調控其表達在癌癥治療方面存在巨大潛力[8-9]。研究表明,miR-138-5p對人腎癌、胰腺癌和鼻咽癌等腫瘤細胞的侵襲、遷移及化療敏感性具有一定的調節(jié)作用[10-12]。但miR-138-5p在人白血病中的作用研究尚未見報道，據報道,四砷四硫化物(As4S4)治療白血病的機制與下調miR-181密切相關,而miR-138被證明對多種癌癥的生存和轉移具有抑制作用[10-13]。另外,HIF-1α的表達增加可加強腫瘤的化學抗輻射性,而通過RNA或小分子靶向抑制HIF-1α能抑制白血病細胞體內外生長[14-15]。故本研究以體外培養(yǎng)的人白血病K562細胞為研究對象,探討miR-138-5p對人白血病K562細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人白血病K562細胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermofisher公司,實時熒光定量PCR儀購自美國AB公司,電泳儀和半干轉膜儀購自美國伯樂公司,Gel View 6000化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司,超凈工作臺購自蘇州中亞凈化設備有限公司,RPMI1640、胎牛血清及TurboFect Transfection Regent脂質體轉染試劑均購自Thermo Fisher公司,熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司,RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司,抗體均購自英國Abcam公司;引物使用Primer 5.0軟件設計,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。miR-138 mimic、pc-HIF-1α及含HIF-1α野生型/突變型的熒光素酶報告基因質粒載體均由上海Genepharm公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人白血病K562細胞,培養(yǎng)條件為37 ℃,5% CO2。每2～3 d換液1次,當細胞融合率達80%時可進行傳代。取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組與轉染

將K562細胞分為K562組、miR-138 mimic組、HIF-1α過表達組(pc-HIF-1α組)和共轉染組(mimic+pc-HIF-1α組)。嚴格按照轉染試劑說明書,將miR-138-5p mimic和pc-HIF-1α單獨或共轉染入K562細胞中,此外另設mimic-scramble組作為miR-138-5p mimic轉染的陰性對照，轉染48 h后進行相應檢測。

1.4 熒光素酶報告實驗

嚴格按照說明書,將HIF-1α野生型/突變型載體或/和miR-138-5p mimic轉染入K562細胞中,培養(yǎng)48 h后,3 500 r/min離心2 min，小心吸棄培養(yǎng)基。PBS洗滌細胞后,再加入細胞裂解液,于室溫下振蕩5～10 min,收集并在3 000 r/min條件下離心5 min,取上清進行檢測。

1.5 實時定量PCR檢測miR-138-5p和HIF-1α mRNA相對表達水平

收集各組細胞,嚴格按照試劑盒說明書,提取細胞總RNA并反轉成cDNA,然后用引物進行qRT-PCR。miR-138-5p引物,上游:5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;HIF-1α引物,上游:5′-TTGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3′,下游:5′-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3′;GAPDH 引物,上游:5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′,下游:5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。按照試劑盒說明書進行檢測,用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.6 CCK8實驗檢測細胞增殖

培養(yǎng)結束后,每孔加入10 μL CCK8溶液,繼續(xù)孵育4 h,采用酶標儀在450 nm波長處檢測各組細胞的吸光度。細胞生長倍數=各組目標時間吸光度/0 h吸光度。

1.7 Western blot檢測HIF-1α、Ki67、PCNA、VEGF、N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達水平

收集各組細胞,經PBS洗滌3次后,提取總蛋白,用BCA法定量蛋白,取等量變性后蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。然后用5%的牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)封閉1 h,再加入適當稀釋濃度的一抗,4 ℃孵育過夜。第2天洗膜后加入適當稀釋濃度的辣根過氧化物酶標記的相應二抗,室溫孵育1 h。滴加發(fā)光液曝光,于凝膠成像儀中拍照,并統(tǒng)計灰度值以計算相對蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-138-5p與HIF-1α的靶向關系

生物信息學結果顯示,miR-138-5p與HIF-1α的3′UTR端存在連續(xù)的結合位點,提示兩者可能存在靶向關系。熒光素酶報告實驗結果顯示,結合位點突變前后,細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但野生型HIF-1α質粒與miR-138 mimic共轉染細胞后,K562細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而突變型HIF-1α質粒與miR-138-5p mimic共轉染細胞后,K562細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05),見圖1。上述結果提示,miR-138-5p能靶向HIF-1α。

圖1 miR-138-5p靶向HIF-1α

2.2 miR-138對K562細胞HIF-1αmRNA表達的影響

qRT-PCR實驗結果顯示,miR-138 mimic組miR-138-5pmRNA表達高于K562組,HIF-1α mRNA表達則低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);而mimic-scramble組miR-138-5p和HIF-1α的mRNA表達水平與K562組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2。上述結果提示,miR-138 mimic能下調HIF-1αmRNA在人白血病K562細胞中的表達水平。

2.3 miR-138對K562細胞中HIF-1α蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,miR-138 mimic組HIF-1α蛋白表達水平顯著低于K562組,而pc-HIF-1α組高于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);同時,mimic+pc-HIF-1α組HIF-1α蛋白表達少于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。上述結果提示,miR-138-5p mimic能下調人白血病K562細胞中HIF-1α蛋白的表達。

a:miR-138-5p mRNA相對表達量;b:qRT-PCR檢測K562細胞中HIF-1α mRNA相對表達量 *:與K562組比較,P<0.01

圖2 qRT-PCR檢測K562細胞中miR-138-5p和HIF-1α mRNA表達水平

a:Western blot檢測K562細胞中HIF-1蛋白表達的電泳圖;b:相對表達量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖3 Western blot檢測K562細胞中HIF-1α蛋白的表達

2.4 miR-138-5p靶向HIF-1α對K562細胞增殖影響

CCK-8實驗結果顯示，miR-138 mimic組K562細胞增殖倍數低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);pc-HIF-1α組K562細胞增殖倍數高于K652組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組K562細胞增殖倍數低于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖4。上述結果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對人白血病K562細胞增殖能力有抑制作用。

*:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖4 CCK-8法檢測K562細胞增殖

2.5 miR-138-5p靶向HIF-1α對K562細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，miR-138 mimic組侵襲細胞數量少于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);pc-HIF-1α組侵襲細胞數量多于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組侵襲細胞數量少于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖5。上述結果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對人白血病K562細胞侵襲能力有抑制作用。

2.6 miR-138-5p靶向HIF-1α對K562細胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測結果顯示:miR-138 mimic組劃痕閉合率低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);而pc-HIF-1α組劃痕閉合率高于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組劃痕閉合率低于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖6。上述結果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對人白血病K562細胞遷移能力有抑制作用。

a:Transwell檢測K562細胞侵襲能力(結晶紫染色×400);b:Transwell定量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖5 Transwell檢測K562細胞侵襲能力

a:劃痕實驗檢測K562細胞遷移能力(×200);b:劃痕實驗定量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

2.7 miR-138-5p靶向HIF-1α對K562細胞增殖和EMT相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，miR-138 mimic組增殖蛋白(Ki67、PCNA)、遷移標記蛋白(VEGF)和間質標記蛋白(N-cadherin)表達低于K562組,而上皮標記蛋白(E-cadherin)表達高于K562組,差異均具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01);pc-HIF-1α組則正好相反(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組Ki67、PCNA、VEGF和N-cadherin表達低于pc-HIF-1α組(P<0.01),E-cadherin蛋白表達高于pc-HIF-1α組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖7。以上結果說明,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人白血病K562細胞的增殖和轉移能力。

3 討論

miR在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,參與調節(jié)多種腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等,被認為是癌癥靶向治療的潛在作用靶點。尋找合適的靶點對癌癥的靶向治療具有重要作用,在針對腫瘤細胞起作用的同時減少機體毒副作用是靶向藥物實現(xiàn)理想療效的重要目標。本研究通過體外培養(yǎng)人白血病K562細胞,旨在探討miR-138-5p與HIF-1α的靶向關系及其對人白血病K562細胞體外生長和轉移特性的影響。

a:Western blot檢測K562細胞增殖能力;b:Western blot檢測K562細胞轉移能力;c:Western blot檢測K562細胞增殖能力定量分析結果;d:Western blot檢測K562細胞轉移能力定量分析結果 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖7 Western blot檢測K562細胞增殖和轉移能力

細胞異常增殖是腫瘤的一大特點,miR在調節(jié)癌細胞增殖方面具有重要作用。Wang等[16]的研究發(fā)現(xiàn),miR-335在多種癌癥中發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制因子作用,能靶向抑制BCL-WmRNA的表達,從而降低透明細胞腎細胞癌786-O和CaKi-1細胞的增殖和侵襲能力。miR-34a靶向HMGB1從而促進急性髓細胞白血病細胞凋亡和抑制其自噬[17]。而Yu等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向抑制FOXC1從而減弱胰腺癌細胞的增殖能力;此外,miR-138-5p靶向抑制程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)可降低人結直腸癌細胞的增殖能力[19]。本研究通過生物學預測miR-138-5p與HIF-1α存在連續(xù)的結合位點,并進一步采用熒光素酶報告實驗加以證實。之后我們采用CCK-8法發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向HIF-1α能顯著降低人白血病K562細胞的體外增殖能力。Western blot結果也證明,miR-138-5p靶向HIF-1α能有效抑制人白血病K562細胞中增殖關鍵蛋白Ki67和PCNA的蛋白水平,從而實現(xiàn)對其體外生長能力的抑制作用。

癌細胞的侵襲轉移能力在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中至關重要,miR已被證明可調節(jié)多種腫瘤細胞的侵襲轉移能力。研究發(fā)現(xiàn),miR-141通過靶向調控促紅細胞生成素產生肝細胞受體A2的表達，從而抑制腎癌786-O和A498細胞侵襲[20];miR-155調節(jié)BRG1表達從而抑制多種人白血病和淋巴瘤DLBCL細胞的增殖和轉移[21]。值得注意的是,miR-138-5p對膀胱癌細胞侵襲能力的調節(jié)作用是通過靶向凋亡抑制蛋白家族關鍵成員Survivin實現(xiàn)的,而靶向上皮細胞自我更新關鍵蛋白δNp63則是miR-138-5p抑制口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲能力的機制[22-23]。本研究結果則發(fā)現(xiàn),miR-138-5p可通過靶向并抑制HIF-1α蛋白和mRNA表達水平,進而減少體外培養(yǎng)的人白血病K562細胞的侵襲細胞數量和劃痕閉合率,即降低K562細胞的體外侵襲轉移能力。

上皮間質轉化是指上皮細胞失去極性和細胞獲得間質特性從而增加細胞轉移和侵襲能力的過程,是多種腫瘤發(fā)生轉移和侵襲的重要過程[24-25]。研究發(fā)現(xiàn),VEGF的表達水平與肺癌預后有一定的相關性,其高表達能促進腫瘤浸潤轉移[26]。E-cadherin是一種重要的細胞黏附因子,參與并介導細胞之間相互黏附,維持細胞間的黏附及組織完整性,相當于一種抑癌因子,與多種腫瘤的侵襲轉移密切相關,其低表達或者表達缺失被認為是腫瘤上皮間質轉化的關鍵步驟[27]。Xiao等[28]研究發(fā)現(xiàn),在小細胞肺癌中,miR-138-5p可靶向抑制Yes相關蛋白1,從而對細胞遷移起到抑制作用;Zhu等[29]研究發(fā)現(xiàn),在骨肉瘤細胞中,miR-138-5p可靶向抑制組蛋白甲基化轉移酶從而實現(xiàn)對腫瘤細胞遷移能力的抑制和對順鉑的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向抑制HIF-1α表達同樣抑制了人白血病K562細胞的遷移能力,同時Western blot實驗也證實K562細胞遷移能力的抑制與抑制間質標記蛋白、遷移標記蛋白表達和促進上皮標記蛋白的表達水平相關。

綜上所述,在體外培養(yǎng)的人白血病K562細胞中,miR-138-5p靶向并抑制HIF-1α表達水平,從而對K562細胞體外增殖、侵襲和遷移能力產生抑制作用。本課題組下一步計劃建立人白血病移植瘤動物模型,探討miR-138-5p對人白血病細胞體內生長和成瘤的影響,以期為白血病靶向治療提供參考。