藕節(jié)多酚超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗油脂氧化能力研究

王占一，葛笑昆，周婉梅，孫曉梅，鄒曉彤，向 蘭

(1.棗莊學院 食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160； 2.山東大學 藥學院，濟南 250012)

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)，是睡蓮科蓮屬水生植物，在我國南北各地均有栽培。藕為蓮的根莖，是一種在我國種植歷史悠久、產(chǎn)量巨大的傳統(tǒng)水生蔬菜[1]。藕節(jié)為藕干燥的莖節(jié)部分，是一種傳統(tǒng)的中藥材，早在唐朝甄權所著《藥性論》中就有記載，稱其具有收斂止血、化瘀之功效。藕節(jié)也是《中國藥典》(2015版)收載的中藥品種，用于治療肺結核咯血、胃出血、鼻出血、吐血、便血等病癥[2]。藕節(jié)質地堅硬，食用困難，因此多數(shù)情況下常作為廢物遺棄，造成資源浪費。近年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)，藕節(jié)中含有多種生物活性物質，如多糖、生物堿、多酚等。多酚已成為人們研究的熱點，周瑋靖等[3]對提取純化的藕節(jié)多酚類成分進行體外抗氧化活性分析，發(fā)現(xiàn)藕節(jié)中多酚類成分含量高，抗氧化活性較好。

超聲波輔助溶劑提取法借助于超聲波的空化作用、機械振動破壁效應破壞植物細胞壁，使植物細胞內的天然產(chǎn)物能夠在短時間內釋放，從而使天然產(chǎn)物不被氧化變質，保持原有的生物活性[4-6]。目前，超聲波輔助溶劑提取法在天然產(chǎn)物提取領域中已被廣泛應用。張雪春等[7]采用超聲波輔助溶劑提取法提取文冠果殼中多酚類成分，并對其體外抗氧化能力進行分析。蔣邊等[8]采用響應面法優(yōu)化了超聲波輔助溶劑提取楊桃中多酚類成分。而采用超聲波輔助溶劑提取法提取藕節(jié)中多酚類成分的試驗研究，國內外鮮有文獻報道。

食用油脂在儲運期間由于受光照、溫度及濕度等影響，容易氧化酸敗，產(chǎn)生對人體有害的過氧化物、自由基等[9]。目前，食用油脂中常添加的抗氧化劑有丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和特丁基對苯二酚(TBHQ)等，長期食用這些人工合成的抗氧化劑是否會對人體健康產(chǎn)生影響，一直存在爭論。因此，積極尋找天然、可食用、高效的油脂抗氧化劑具有重要意義。植物多酚是天然的抗氧化劑，食用油脂中加入植物多酚類成分，能顯著減緩油脂氧化進程[10]。因此，本試驗以微山湖產(chǎn)藕節(jié)為原料，采用響應面法優(yōu)化其多酚類成分的提取工藝，并將純化多酚用于抗油脂氧化活性分析，以期為藕節(jié)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

藕，采自微山湖，手工取其根莖節(jié)部，經(jīng)棗莊學院閆志佩教授鑒定為正品藕節(jié)。藕節(jié)在50℃下干燥48 h后粉碎，過24目篩，備用。

沒食子酸對照品(純度﹥99%，批號為110831-201204)，由中國食品藥品檢定研究院提供；福林酚(分析純)，美國Sigma公司；抗壞血酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；豬油、新榨花生油(未加入抗氧化劑)，市購；硫代硫酸鈉、無水乙醇、D-101大孔吸附樹脂、碳酸鈉、碘化鉀等均為分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；超純水，由UPW-P型超純水系統(tǒng)制備。

1.1.2 儀器與設備

UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；B-26型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FA1104型電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司；800Y型高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限公司；HN-CQY型低溫超聲波萃取儀(功率100～1 500 W，連續(xù)可調，頻率25 kHz)，上海汗諾儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藕節(jié)多酚的提取

準確稱取藕節(jié)粉3.0 g，置于250 mL燒杯中，加入一定體積分數(shù)的乙醇，用保鮮膜、橡皮筋封口，置于超聲波萃取儀中，設置超聲波輸出功率350 W、超聲頻率25 kHz，在一定溫度下提取一定時間后，抽濾，濾液定容至100 mL，用D-101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附，70%乙醇洗脫后，用0.45 μm濾膜過濾，減壓蒸干得到藕節(jié)多酚。

1.2.2 多酚含量的測定

參照文獻[11]的方法，略有改動。將沒食子酸對照品恒溫干燥至恒重后，精密稱取50 mg，置于100 mL燒杯中，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，即得質量濃度為1 mg/mL沒食子酸對照品溶液。分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL沒食子酸對照品溶液，置于25 mL具塞刻度試管中，依次加入10%福林酚試劑12.5 mL、7.5%Na2CO3溶液10 mL，充分搖勻并用蒸餾水定容至25 mL，于25℃下避光反應2 h，在760 nm波長處測定吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標，沒食子酸質量濃度(C)為橫坐標，得到標準曲線回歸方程A=0.017C-0.002 1(r=0.999 5)，沒食子酸質量濃度在8～48 μg/mL范圍內線性關系良好。

準確稱取藕節(jié)多酚5.0 g，用體積分數(shù)為70%的乙醇定容至25 mL，作為樣品溶液，按上述方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品溶液中多酚的質量濃度，按下式計算多酚純度及得率。

純度=(樣品溶液中多酚的質量濃度×樣品溶液體積)/藕節(jié)多酚質量×100%

得率=(藕節(jié)多酚的質量×純度)/藕節(jié)質量×100%

1.2.3 藕節(jié)多酚抗油脂氧化能力測試

精密稱取藕節(jié)多酚0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg，抗壞血酸1.5 mg，并以空白油樣作對照，分別置于100 mL燒杯中，依次加入5.0 mL重蒸餾水、50 g豬油或50 mL花生油，攪拌均勻后，放入(60±1)℃恒溫干燥箱中儲存，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16 d取樣2 g測定過氧化值(POV)。過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016。

2 結果與分析

2.1 藕節(jié)多酚提取單因素試驗

2.1.1 超聲時間對藕節(jié)多酚得率的影響

在超聲溫度50℃、料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)70%條件下，考察超聲時間對藕節(jié)多酚得率的影響，結果見圖1。

圖1 超聲時間對藕節(jié)多酚得率的影響

由圖1可見，隨著超聲時間的延長，藕節(jié)多酚得率逐漸增大，在超聲時間為35 min時達到最大值，之后隨著超聲時間的延長，藕節(jié)多酚得率呈下降趨勢，這可能是由于多酚類成分長時間接觸空氣，其自身被氧化，從而導致多酚得率下降。因此，確定超聲時間在35 min左右。

2.1.2 超聲溫度對藕節(jié)多酚得率的影響

在超聲時間35 min、料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)70%條件下，考察超聲溫度對藕節(jié)多酚得率的影響，結果見圖2。

圖2 超聲溫度對藕節(jié)多酚得率的影響

由圖2可見，隨著超聲溫度的升高，藕節(jié)多酚得率呈上升趨勢，在50℃時達到最大值，之后隨著超聲溫度的升高，藕節(jié)多酚得率呈下降趨勢，這可能是由于高溫使藕節(jié)多酚結構被破壞，從而導致其得率下降。因此，確定超聲溫度在50℃左右。

2.1.3 料液比對藕節(jié)多酚得率的影響

在超聲時間35 min、超聲溫度50℃、乙醇體積分數(shù)70%條件下，考察料液比對藕節(jié)多酚得率的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對藕節(jié)多酚得率的影響

由圖3可見，隨著溶劑用量的增加，藕節(jié)多酚得率呈上升趨勢，這是由于增大溶劑用量，有利于多酚類成分由原料內部向溶劑中擴散。當料液比大于1∶20 時，隨著溶劑用量的增加，多酚得率基本保持不變。從節(jié)約資源角度考慮，確定料液比在1∶20左右。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對藕節(jié)多酚得率的影響

在超聲時間35 min、超聲溫度50℃、料液比1∶20條件下，考察乙醇體積分數(shù)對藕節(jié)多酚得率的影響，結果見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對藕節(jié)多酚得率的影響

由圖4可見，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，藕節(jié)多酚得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當乙醇體積分數(shù)為70%時，藕節(jié)多酚得率最高，這是由于多酚類成分屬于極性較弱的物質，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，溶劑極性與藕節(jié)多酚極性之間的差異較小，使藕節(jié)多酚得率逐漸增大，但當乙醇體積分數(shù)超過70%時，藕節(jié)多酚得率開始下降，可能是溶劑極性與藕節(jié)多酚極性之間的差異增大導致的。因此，確定乙醇體積分數(shù)在70%左右。

2.2 藕節(jié)多酚提取響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取超聲時間(X1)、超聲溫度(X2)、料液比(X3)和乙醇體積分數(shù)(X4)作為Box-Behnken響應面試驗設計的4個自變量，以多酚得率(Y)為響應值，通過響應面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取藕節(jié)多酚的工藝條件。響應面試驗因素水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

注：**表示差異極顯著(p<0.01)；*表示差異顯著(p﹤0.05)；模型的R2=0.924 4。

通過Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析，得到超聲波輔助提取藕節(jié)多酚最佳工藝條件：超聲時間33.54 min，超聲溫度50.08℃，料液比1∶19.8 ，乙醇體積分數(shù)70.38%。在最佳工藝條件下，藕節(jié)多酚得率預測值為7.12%。因上述試驗條件在實際操作中無法實現(xiàn)，因此將試驗條件修正為超聲時間34 min、超聲溫度50℃、料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)70%。在最佳工藝條件下進行3次平行試驗，藕節(jié)多酚平均得率為(7.11±0.14)%，與模型預測值相當，說明模型能較好地預測藕節(jié)多酚得率。經(jīng)測定，藕節(jié)多酚的純度為79.8%。

2.3 藕節(jié)多酚抗油脂氧化能力

2.3.1 藕節(jié)多酚抗動物油脂氧化能力(見圖5)

由圖5可見，動物油脂在恒溫箱中高溫誘導后，發(fā)生了自氧化反應，隨著誘導時間的延長，空白對照組的過氧化值逐漸增大，表明高溫能使動物油脂的自氧化反應加劇。動物油脂中添加藕節(jié)多酚后，5組不同添加量的油樣，與空白對照組比較，其過氧化值增加趨勢明顯減緩，且隨著藕節(jié)多酚添加量的增加，其抗動物油脂氧化能力明顯增強，量效對應關系比較顯著。藕節(jié)多酚添加量達到2.5 mg時，其抗氧化能力接近1.5 mg的抗壞血酸所達到的效果，其作用機制可能是藕節(jié)多酚分子中含有酚羥基，可提供活潑的氫質子，能夠有效地清除氧自由基，從而可以預防脂質過氧化的啟動；其次，酚羥基和過氧化自由基結合生成穩(wěn)定的化合物，進一步阻止了氧化過程中鏈鎖反應的傳播。

圖5 藕節(jié)多酚抗動物油脂氧化能力

2.3.2 藕節(jié)多酚抗植物油脂氧化能力(見圖6)

圖6 藕節(jié)多酚抗植物油脂氧化能力

由圖6可見，植物油脂在恒溫箱中高溫誘導后，同樣加快了自身氧化進程，植物油脂中添加藕節(jié)多酚后，5組不同添加量的油樣，與空白對照組比較，其過氧化值增加趨勢明顯減緩，且隨著添加量的增加，其抗植物油脂氧化能力明顯增強，量效對應關系比較顯著。

3 結 論

本試驗以微山湖產(chǎn)藕節(jié)為原料，在單因素試驗基礎上，結合響應面試驗設計優(yōu)化得出超聲波輔助提取藕節(jié)多酚的最佳工藝條件為超聲時間34 min、超聲溫度50℃、料液比1∶20和乙醇體積分數(shù)70%，在此條件下藕節(jié)多酚得率為(7.11±0.14)%。藕節(jié)多酚能夠有效減緩豬油和花生油的氧化酸敗速率，并且隨著多酚添加量的提高，其抗油脂氧化能力呈遞增趨勢。藕節(jié)多酚是很好的天然油脂抗氧化劑，具有一定的開發(fā)潛力。