尿素包合法富集駝峰油中不飽和脂肪酸的工藝優(yōu)化

張 霞，郝曉麗，何 靜，吉日木圖,2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古駱駝研究院，內(nèi)蒙古 巴丹吉林 737300)

我國是世界上雙峰駱駝主要產(chǎn)地之一[1]，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古、青海、 甘肅等省的戈壁和草原上。研究表明，成年雙峰駝駝峰占其體重的20%[2]，駝峰中90%是脂肪。研究證實(shí)，駝峰脂肪中富含VA(5.6 mg/kg)和VE(19.4 mg/kg)[3]，有較低含量的膽固醇[2]，雙峰駝較單峰駝?dòng)休^高含量的α-亞麻酸，所以雙峰駝的駝峰脂肪具有極高的研究價(jià)值。

駱駝脂肪營養(yǎng)豐富、性質(zhì)穩(wěn)定，是食品、化妝品及化工行業(yè)的優(yōu)質(zhì)資源，將精煉駝峰油進(jìn)一步富集不飽和脂肪酸，可提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，研究人員對于不飽和脂肪酸的富集研究多為植物油和海洋生物油等，畜類動(dòng)物油相對較少，駱駝?dòng)椭牟伙柡椭舅岣患巧僖?。富集不飽和脂肪酸常用的方法有超臨界流體萃取法、分子蒸餾法、柱層析法、冷凍結(jié)晶法及尿素包合法等[4-7]。尿素包合法成本低、設(shè)備簡單、易操作[8-11]。因此，本研究采用尿素包合法富集精煉駝峰油中的不飽和脂肪酸，以碘值為指標(biāo)，探究脲脂比、脲醇比、包合溫度、包合時(shí)間對包合效果的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化富集工藝，并對其脂肪酸組成及含量進(jìn)行分析測定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

精煉駝峰油，內(nèi)蒙古駱駝研究院；95%乙醇、氫氧化鉀、尿素、正己烷、環(huán)己烷、冰乙酸、濃鹽酸、碘化鉀、一氯化碘、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、重鉻酸鉀、淀粉、硫代硫酸鈉等，均為分析純，北京索萊寶科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品。

PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；JC-HH-S24恒溫水浴鍋；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；CLT-1A型智能磁力攪拌電熱套；GC7890B氣相色譜儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備[12]

稱取100 g精煉駝峰油預(yù)熱，將22.5 g KOH、175 mL 95%乙醇、87.5 mL超純水與預(yù)熱駝峰油加入三口瓶中，80℃下回流2 h，冷卻至室溫后用6 mol/L的HCl調(diào)pH至2～3，加入正己烷于分液漏斗中萃取兩次，靜置，棄水層，超純水水洗有機(jī)相至中性，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，得到混合脂肪酸。

1.2.2 不飽和脂肪酸的富集

稱取20 g混合脂肪酸，加入一定比例95%乙醇和尿素，80～85℃下回流至溶液均勻混合或澄清，冷卻至室溫，相應(yīng)溫度下包合一定時(shí)間后抽濾，分離固相結(jié)晶物，將濾液用鹽酸調(diào)pH至2～3，正己烷萃取有機(jī)相，5% NaCl溶液水洗至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，得到富集后的不飽和脂肪酸。富集效果衡量指標(biāo)為碘值和得率。碘值的測定，參照GB/T 5532—2008。不飽和脂肪酸得率按下式計(jì)算。

Y=m1/m×100%

式中：Y為不飽和脂肪酸得率；m1為尿素包合富集后不飽和脂肪酸質(zhì)量，g；m為混合脂肪酸的質(zhì)量，g。

1.2.3 脂肪酸組成及含量的測定

采用三氟化硼催化油脂甲酯化，以脂肪酸甲酯標(biāo)樣的保留時(shí)間定性，面積歸一化法定量。

氣相色譜條件：SP2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；FID檢測器；柱箱溫度120℃保持5 min，以3℃/min升至230℃，保持3 min，以1.5℃/min升至240℃，保持13 min；檢測器溫度260℃；汽化室溫度260℃；氫氣流速30.0 mL/min；空氣流速300.0 mL/min；氮?dú)饬魉?.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比10∶1。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPadPrism 6作圖分析并借助Design Expert8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。對樣品進(jìn)行3次平行測定，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 脲脂比對包合效果的影響

在包合溫度0℃，尿素質(zhì)量與95%乙醇體積比(脲醇比，下同)3∶8，包合時(shí)間18 h，尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比(脲脂比，下同)分別為2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1的條件下考察包合效果，結(jié)果見圖1。

圖1 脲脂比對包合效果的影響

由圖1可知：隨著脲脂比的增加，碘值呈上升趨勢，尿素用量較少時(shí)，碘值較小，包合效果差，富集后產(chǎn)物常溫下呈固液渾濁狀；當(dāng)脲脂比為3∶1時(shí)，碘值上升顯著，富集后產(chǎn)物常溫下呈澄清液態(tài)；當(dāng)尿素用量繼續(xù)增加時(shí)，碘值稍有增加，但是上升趨勢平緩。隨著脲脂比的增加，得率下降趨勢顯著，脲脂比2∶1時(shí)，得率為29%，但是碘值最低；脲脂比3∶1 時(shí)，得率為15%，脲脂比3.5∶1時(shí)，得率下降到10%并且仍在減少，但是碘值變化趨勢平緩；由于尿素用量過多，不能夠與乙醇充分溶解，抽濾過程中產(chǎn)物損失較大。因此，綜合考慮選擇脲脂比3∶1為最適條件。

2.1.2 脲醇比對包合效果的影響

在包合溫度0℃，包合時(shí)間18 h，脲脂比3∶1，脲醇比分別為3∶6、3∶7、3∶8、3∶9、3∶10、3∶11條件下考察包合效果，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著脲醇比的增加，碘值先上升后下降，當(dāng)脲醇比為3∶8時(shí)，碘值達(dá)到最大。尿素包合過程中，乙醇作為溶劑，當(dāng)乙醇較少時(shí)，尿素不能被充分溶解，尿素與飽和脂肪酸形成結(jié)晶體不充分，導(dǎo)致包合效果差；當(dāng)乙醇用量過大時(shí)，尿素過度分散在乙醇中，不能很好地與飽和脂肪酸形成結(jié)晶體，導(dǎo)致碘值下降明顯。脲醇比對于富集后得率影響較小，脲醇比為3∶6～3∶11，得率僅為10%～15%，由于乙醇的增加，油脂游離在乙醇中，有些飽和脂肪酸也不能很好地與尿素形成結(jié)晶體，導(dǎo)致富集后得率上升，碘值降低。綜合考慮，選擇脲醇比3∶8為最適條件。

2.1.3 包合溫度對包合效果的影響

在脲脂比3∶1，脲醇比3∶8，包合時(shí)間18 h，包合溫度分別為-20、-10、0、10、20℃條件下考察包合效果，結(jié)果見圖3。

圖3 包合溫度對包合效果的影響

由圖3可知，隨著包合溫度的升高碘值變化范圍較小，包合溫度對于包合效果影響較小。溫度對尿素包合反應(yīng)影響較為復(fù)雜，一方面升高溫度加快反應(yīng)速率，另一方面升高溫度也有利于化學(xué)平衡向吸熱反應(yīng)方向移動(dòng)[13]。當(dāng)包合溫度為0℃時(shí)碘值最高。尿素包合過程一般在低溫狀態(tài)下能夠很好地形成結(jié)晶體，但是溫度過低時(shí)碘值和得率偏低，當(dāng)溫度達(dá)到20℃時(shí)，碘值較低，富集后得率增加，此時(shí)產(chǎn)物呈現(xiàn)固液渾濁狀，包合效果較差。因此，綜合考慮選擇0℃為最佳包合溫度。

2.1.4 包合時(shí)間對包合效果的影響

在脲脂比3∶1，脲醇比3∶8，包合溫度0℃，包合時(shí)間分別為6、12、18、24、30 h條件下考察包合效果，結(jié)果見圖4。

圖4 包合時(shí)間對包合效果的影響

由圖4可知：當(dāng)包合時(shí)間為6 h時(shí)，碘值相對較低，富集后得率相對較低，產(chǎn)物呈渾濁狀，包合不充分；包合時(shí)間為12 h時(shí)，碘值上升，18 h時(shí)碘值最高，得率也最高；之后隨著包合時(shí)間的延長碘值下降不明顯，但是得率呈明顯下降趨勢，可能部分低不飽和脂肪酸也形成包合物，從而導(dǎo)致得率下降。綜合考慮，選擇包合時(shí)間18 h為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken模型，以碘值為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定脲醇比為3∶8，以脲脂比、包合時(shí)間、包合溫度為主要考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表2

試驗(yàn)號(hào)ABC碘值(I)/(g/100 g)100-1-1111.80811-1-10106.2611201-1119.86013000124.8701410197.85415000124.28216000125.39817000125.660

2.2.2 模型建立及顯著性分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到碘值(Y)的回歸方程為：Y=126.34+5.11A-0.66B-3.09C+1.08AB-5.38AC-2.51BC-15.47A2-3.67B2-9.02C2。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

注：差異顯著P<0.05(*);差異極顯著P<0.01(**)。

由表3可知：方差分析模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明此模型與實(shí)際情況相擬合；脲脂比、包合溫度對包合效果影響極顯著、顯著；脲脂比與包合溫度交互作用影響顯著；脲脂比、包合溫度二次項(xiàng)影響極顯著。由此可見各因素對產(chǎn)物碘值的影響順序依次為A(脲脂比)>C(包合溫度)>B(包合時(shí)間)，即尿素用量影響最大，包合溫度影響次之，包合時(shí)間影響最小。

2.2.3 富集工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型分析，通過Design-Expert 8.0軟件得到尿素包合法最優(yōu)工藝條件為脲脂比3.315∶1、包合溫度-2.37℃、包合時(shí)間18.13 h，在此條件下產(chǎn)物碘值(I)為127.23 g/100 g，以富集工藝優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測定尿素包合后產(chǎn)物的碘值，3組試驗(yàn)碘值(I)的平均值為125.73 g/100 g。由于動(dòng)物油脂所含不飽和脂肪酸相對較少，碘值一般較低，但是試驗(yàn)結(jié)果碘值相對較高，并且與預(yù)測值結(jié)果相近，說明此模型方程與實(shí)際情況擬合度較好，響應(yīng)面優(yōu)化尿素包合富集駝峰油中不飽和脂肪酸的方法是可行的。

2.3 尿素包合前后脂肪酸組成及含量

將包合前后脂肪酸組成及含量進(jìn)行對比分析，結(jié)果見表4。

表4 尿素包合前后37種脂肪酸組成及含量 %

續(xù)表4 %

脂肪酸包合前包合后C22∶2--C24∶0-0.152 7C20∶5n3--C24∶1--C22∶6n3-0.152 7SFA54.024 3a07.802 5bMUFA34.645 7a58.175 6aPUFA04.645 3a17.322 2bn-6PUFA03.227 0a12.011 5bn-3PUFA01.418 3a05.127 7b

注：同一行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

研究表明，人體過多攝入飽和脂肪酸時(shí)會(huì)導(dǎo)致高血脂、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[14]。由表4可知：尿素包合前后SFA含量分別為54.024 3%、7.802 5%，降低約46個(gè)百分點(diǎn)，差異顯著(P<0.05)，其中棕櫚酸和硬脂酸含量下降極為明顯；尿素包合前后MUFA含量分別為34.645 7%、58.175 6%，增加近24個(gè)百分點(diǎn)，其主要成分為油酸，包合后油酸含量增長約3個(gè)百分點(diǎn)，說明尿素包合駝峰油時(shí)降低了油酸的損耗；尿素包合前后PUFA含量分別為4.645 3%、17.322 2%，包合后增長約13個(gè)百分點(diǎn)，與已見報(bào)道中所測家禽類相比，接近雞油(15.53%)[15]。包合前后PUFA/SFA分別為0.086 0、2.220 1，差異顯著(P<0.05)，說明包合后富集多不飽和脂肪酸效果明顯。包合前后n-6PUFA含量分別為3.227 0%、12.011 5%，其中主要增長的成分為亞油酸。而包合前后n-3PUFA含量分別為1.418 3%、5.127 7%，增加近4個(gè)百分點(diǎn)。上述結(jié)果表明，尿素包合后產(chǎn)物成分多為不飽和脂肪酸，并且外觀為淡黃色黏稠液態(tài)。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法確定尿素包合富集駝峰油中不飽和脂肪酸的最佳工藝條件為尿素質(zhì)量與95%乙醇體積比3∶8、尿素與混合脂肪酸質(zhì)量比3.315∶1、包合溫度-2.37℃、包合時(shí)間18.13 h，在此條件下產(chǎn)物中的飽和脂肪酸含量為7.802 5%，比包合前降低約46個(gè)百分點(diǎn)，不飽和脂肪酸含量約為75%。