參茸五子丸的急性毒性試驗(yàn)研究

焦 玉 黃德紅 楊艷芳 胡思榮 張 荔

1.湖北省襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065

甲狀腺功能低下是老年患者的常見(jiàn)疾病之一，是甲狀腺激素合成及分泌減少或組織利用不佳導(dǎo)致的全身代謝性疾病，96%的甲狀腺低下患者于老年階段發(fā)病[1]。西醫(yī)治療該病以甲狀腺功能達(dá)標(biāo)為主，但整體治療效果有待提高，所以研究領(lǐng)域迫切希望能發(fā)現(xiàn)新的中藥來(lái)完善治療[2]。參茸五子丸為湖北中醫(yī)名師胡思榮主任醫(yī)師多年臨床驗(yàn)方，以古方 “五子衍宗丸” 加減而成。全方以紅參、鹿茸為君藥，能溫腎壯陽(yáng)，用于腎陽(yáng)和精血虧虛而致女子宮寒不孕及甲狀腺功能不足。為了初步評(píng)價(jià)參茸五子丸的安全性，根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]的技術(shù)要求，對(duì)參茸五子丸進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 參茸五子丸，176g/瓶，由襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院提供(批號(hào)：20150216)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 種屬與品系：SPF級(jí)昆明小鼠。性別和數(shù)量：24只小鼠，雌雄各半，用于預(yù)實(shí)驗(yàn)；40只小鼠，雌雄各半，用于正式試驗(yàn)。動(dòng)物體重：18～22g。

預(yù)試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源：湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：No.4200600007058，許可證編號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。

正式試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源：武漢生物制品研究所。試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：No.4200400002876，許可證編號(hào)：SCXK(鄂)2012-0003。

動(dòng)物試驗(yàn)單位：湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：SCXK(鄂)2012-0068。

動(dòng)物的標(biāo)記與識(shí)別：動(dòng)物到達(dá)后，每籠5只，予以標(biāo)注，標(biāo)注課題和小鼠體重等內(nèi)容，并按照試驗(yàn)的要求對(duì)小鼠進(jìn)行編號(hào)。

檢疫時(shí)間：動(dòng)物到達(dá)后檢疫3 d。

飼養(yǎng)管理?xiàng)l件：小鼠飼養(yǎng)在塑料飼養(yǎng)盒中，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(飼料由湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供)，無(wú)干涉自由進(jìn)食及飲水。溫度控制在20～25℃，相對(duì)濕度控制在45%～60%，每周更換墊料2次，消毒給水瓶1次。

1.1.3 試驗(yàn)器材 5號(hào)篩、電子天平、打粉機(jī)、純水儀、1 mL灌胃器、100 mL量筒、常用手術(shù)用具。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 受試藥物的制備方法 將參茸五子丸用打粉機(jī)打粉，過(guò)5號(hào)篩，用純水配制成低、中、高3個(gè)濃度混懸液， 濃度分別為0.291 、0.590、1.15 g·mL-1。

1.2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)小鼠24只，每組8只，雌雄分開，分成低劑量參茸五子丸組、中劑量參茸五子丸組和高劑量參茸五子丸組共3個(gè)組，試驗(yàn)前12 h禁食不禁水。灌胃最大容積為按小鼠體重40.0 mL·kg-1，3個(gè)組灌胃濃度分別為0.291、0.590和1.15 g·mL-1,每日灌胃2次，每次間隔5 h。

灌胃后，正常飼養(yǎng)。連續(xù)5 d觀察小鼠，分別比較體重、活動(dòng)情況、呼吸、皮毛顏色、大小便、喂食等情況和死亡數(shù)目。結(jié)果全部觀察項(xiàng)目(見(jiàn)表1)均正常并且實(shí)驗(yàn)小鼠均存活，未測(cè)得半數(shù)致死數(shù)LD50。因此，以1.15 g·mL-1的為最高濃度測(cè)定最大給藥量，進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2.3 正式試驗(yàn)[4-5]取40只試驗(yàn)小鼠，每組20只，分為2組標(biāo)記為對(duì)照組和參茸五子丸組，雌雄分開，試驗(yàn)前12 h禁食不禁水。小鼠按體重40 mL·kg-1，參茸五子丸組以1.15 g·ml-1藥液濃度濃度，每5 h灌胃1次，每日2次；對(duì)照組按相同方式純水灌胃。給藥后，正常飼養(yǎng)。觀察14 d，比較各組小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、重量、毒性反應(yīng)和死亡數(shù)目。在將兩組中雌雄取均值進(jìn)行比較。

1.2.4 小鼠急性毒性試驗(yàn)觀察 各組灌胃給藥后，按照常規(guī)飼養(yǎng)。 灌胃給藥后2 h之內(nèi)，每15 min觀察1次；2～4 h內(nèi)，每0.5 h觀察1次； 4～6 h內(nèi)，每1 h觀察1次；每天同時(shí)段觀察小鼠的重量、四肢活動(dòng)、飲水和進(jìn)食、皮毛顏色、大小便、死亡等情況。

表1 觀察項(xiàng)目

若小鼠死亡，解剖觀察各臟器改變情況。然后將存活的小鼠頸椎脫臼處死，同時(shí)解剖和觀察小鼠主要臟器的變化。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 小鼠一般狀態(tài)變化和死亡情況見(jiàn)表2、3。

表2 預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠一般狀態(tài)變化

注：N為正常。

表3 預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠死亡情況

2.2 正式實(shí)驗(yàn)

2.2.1 小鼠一般狀態(tài)變化 參茸五子丸組：給藥后0.5 ～1.5 h，小量小鼠活動(dòng)和進(jìn)食飲水變少，但未出現(xiàn)抽搐、麻痹等現(xiàn)象； 也沒(méi)有呼吸困難對(duì)照組：小鼠在1～14 d的觀察時(shí)間之內(nèi)，小鼠各觀察指標(biāo)均正常。

對(duì)照組：小鼠在1～14 d的觀察時(shí)間之內(nèi)，小鼠自發(fā)活動(dòng)、反應(yīng)情況、呼吸、皮毛光澤、飲水、進(jìn)食、二便均正常，沒(méi)有出現(xiàn)任何不正常的狀態(tài)。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.2 小鼠的死亡情況 14 d觀察時(shí)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2.3 小鼠體重變化 參茸五子丸組：小鼠的體重增長(zhǎng)正常，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組：小鼠體重增長(zhǎng)正常。將兩組中雌雄兩組分別計(jì)算均值，再進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6、圖6。

表4 正式試驗(yàn)小鼠一般狀態(tài)變化

注：N表示正常

表5 正式試驗(yàn)小鼠死亡情況

組別參茸五子丸對(duì)照組性別♀♂♀♂♀♂♀♂只數(shù)101020101020初始20.84±0.5621.38±0.4021.11±0.5520.79±0.6721.48±0.4121.14±0.651d24.99±0.80??26.42±1.21??25.71±1.24??24.35±0.86??25.65±0.84??25.00±1.06??2d26.91±1.03??28.53±1.12??27.72±1.34??26.64±1.00??27.87±0.82??27.26±1.09??3d28.58±1.10??30.41±1.23??29.50±1.47??27.81±1.01??30.06±1.14??28.94±1.56??4d29.80±1.74??32.37±1.38??31.09±2.02??29.35±1.33??32.10±1.28??30.74±1.90??5d30.35±2.21??33.91±1.37??32.13±2.56??29.74±1.11??33.58±1.24??31.66±2.28??6d30.23±1.84??34.53±1.62??32.38±2.78??29.76±1.14??34.72±1.48??32.24±2.85??7d31.44±1.46??35.81±1.42??33.63±2.64??30.77±0.88??36.10±1.90??33.44±3.09??8d31.26±1.74??35.60±1.73??33.43±2.80??30.95±1.03??36.52±2.03??33.74±3.26??9d31.64±1.93??36.38±1.88??34.01±3.06??31.10±1.43??37.42±2.34??34.26±3.75??10d32.29±2.04??37.50±2.40??34.90±3.44??31.72±1.60??38.46±2.38??35.09±3.98??11d32.45±1.95??37.81±2.30??35.13±3.45??32.24±1.62??38.81±2.42??35.53±3.92??12d32.68±1.94??37.90±2.27??35.29±3.38??31.91±1.79??38.98±2.40??35.45±4.17??13d33.06±1.79??38.65±2.69??35.86±3.63??32.77±1.81??39.76±2.56??36.27±4.18??14d33.71±1.57??39.13±2.82??36.42±3.56??33.51±1.82??40.96±2.65??37.24±4.42??

注：與初始值相比，**P<0.01。

2.2.4 小鼠尸檢情況 觀察期到后，將所有小鼠頸椎脫臼處死，并尸檢各器官。 結(jié)果：肝、心、脾、肺、腎、胃各臟器的顏色、體積、質(zhì)地等均無(wú)異?，F(xiàn)象。

2.2.5 小鼠的最大給藥量 小鼠的最大給藥量為1.15 g·mL-1×40.00 mL·kg-1×2=92.00 g·kg-1。

按以下公式計(jì)算出最大給藥量倍數(shù)：

小鼠最大給藥量倍數(shù)=每只小鼠的最大給藥量/小鼠平均體重(20 g)1×成人平均體重(50 kg)/成人每日用量

每只小鼠的最大給藥量為：1.15 g·mL-1×0.8 mL×2次=1.84 g

成人臨床日用量為：2.933×10 g/次×3次=87.99 g

小鼠最大給藥量倍數(shù)為：1.84 g/20 g×50000/87.99 g=52.3倍

在參茸五子丸的急性毒性試驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)有出現(xiàn)小鼠死亡的情況，無(wú)法測(cè)出半數(shù)致死量LD50。因此，以1.15 g·mL-1為最大給藥濃度，40.0 mL·kg-1為最大給藥容量灌胃給藥2次，進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。在14 d的觀察時(shí)間內(nèi)，小鼠沒(méi)有出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且體重正常增加，說(shuō)明本品在該劑量下使用對(duì)小鼠是安全的。

3 結(jié)論

“五子衍宗丸”全方組成為：枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、車前子(鹽炒)，為補(bǔ)益劑，具有補(bǔ)腎益精之功效，用于脾腎陽(yáng)虛所致的甲狀腺功能低下等?！皡⑷孜遄油琛睘椤拔遄友茏谕琛奔訙p而成，全方以紅參、鹿茸溫腎助陽(yáng)為君藥；鹽菟絲子、覆盆子、醋五味子、枸杞子、鹽車前子補(bǔ)血填精，補(bǔ)中有瀉，補(bǔ)而不膩為臣藥；淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)加強(qiáng)五子衍宗丸的溫陽(yáng)作用；丹參既能活血又能養(yǎng)血，“能去瘀生新而不傷正”；黃柏苦寒入腎，清虛熱燥濕，以制以上諸藥補(bǔ)益溫陽(yáng)作用太過(guò)，三者同為佐藥；使以陳皮、茯苓、焦山楂、炙甘草以健脾和胃，久服不傷及脾胃。諸藥配伍，溫而不燥，補(bǔ)而不膩。全方重在溫腎陽(yáng)，益精血，輔以健脾胃，清虛熱，使腎陽(yáng)得溫，精血充盈。

參茸五子丸(批號(hào)：20150216)對(duì)昆明小鼠灌胃給藥進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)表明，小鼠沒(méi)有出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且體重正常增長(zhǎng)，無(wú)法測(cè)出LD50；最大給藥量為92.00 g生藥/kg，相當(dāng)于成人臨床日用量1.76 g/kg的52.3倍，說(shuō)明小鼠對(duì)本品的最大耐受劑量大于92.00 g生藥/kg。該制劑在服用劑量范圍內(nèi)安全性良好。