龍金通淋膠囊中龍膽苦苷HPLC測(cè)定結(jié)果的不確定度分析

荀秀彪 張順平

云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 曲靖 655000

龍金通淋膠囊由龍膽、魚腥草、白花蛇舌草、金錢草、梔子、茯苓等12味藥組成，具有清熱利濕、化瘀通淋的功效，臨床用于濕熱瘀阻所致的淋證、尿急、尿頻、尿痛、前列腺炎、前列腺增生見上述證候者[1]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2](WS-10375(ZD-0375)-2002-2012Z)中龍膽苦苷含量測(cè)定方法為高效液相色譜法。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及資料[3-5]，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度進(jìn)行分析，初步建立適用于高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度評(píng)定方法，消除在檢驗(yàn)過(guò)程中可能帶來(lái)的誤差，以控制測(cè)定結(jié)果的有效性和適宜性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津LC-20A型高效液相色譜儀(四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱， 紫外檢測(cè)器)；KQ-300UDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS205DU電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；PURELAB Flex 3一體式超純水儀(英國(guó)ELGA公司)。

1.2 藥品與試劑 龍金通淋膠囊(批號(hào)：190503，云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.46 g/粒，)；龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)：110770-201918，含量為97.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(22∶78)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取市售的龍金通淋膠囊裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率150 W，頻率55 Hz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄出濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 uL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。測(cè)定結(jié)果見表1，色譜圖如圖1所示。

表1 峰面積測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果分析

3.1 數(shù)字模型 按照《中國(guó)藥典》2015版二部規(guī)定，含量計(jì)算公式：

公式中Y為每粒中龍膽苦苷的含量(mg粒)；A供為供試品溶液峰面積；W對(duì)為對(duì)照品稱樣量(mg)；P對(duì)為對(duì)照品純度；V供為供試品溶液的稀釋倍數(shù)；W平均裝量供試品的平均裝量(g)；A對(duì)為對(duì)照品溶液峰面積；W供為供試品稱樣量(g)；V對(duì)為對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)。

3.2 不確定度的來(lái)源分析 從公式中可以看出龍膽苦苷的含量測(cè)定不確定度主要來(lái)源于供試品溶液峰面積；供試品稱樣量；供試品溶液的稀釋倍數(shù)；供試品的平均裝量；對(duì)照品純度；對(duì)照品稱樣量；對(duì)照品溶液峰面積；對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)以及高效液相色譜儀測(cè)量帶來(lái)的不確定度。

3.3 各分量不確定度的量化評(píng)定

3.3.4 對(duì)照品峰面積引入的相對(duì)不確定度urel(AR) 樣品在測(cè)試過(guò)程中受進(jìn)樣體積重復(fù)性、泵流速的穩(wěn)定性、分離的重復(fù)性、組分在色譜柱滯留變化、檢測(cè)器的穩(wěn)定性、積分變動(dòng)性等隨機(jī)變化的影響，可合并為進(jìn)樣重復(fù)性進(jìn)行測(cè)量[7]，屬于A類不確定度。對(duì)照品1重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積為534.5、534.2、537.6、535.8、535.3，平均值為535.5，對(duì)照品1峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

則對(duì)照品峰面積引入的相對(duì)不確定度：

3.3.5 供試品稱量引起的相對(duì)不確定度urel(WX) 此不確定度的分析同3.3.2項(xiàng)。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(WX)=1.30×10-1mg。兩份供試品稱樣量為605.23 mg和602.25 mg，其相對(duì)不確定度為：

=2.80×10-2，其相對(duì)不確定度：urel(Vx)=2.80×10-250=5.60×10-4。

3.3.9 高效液相色譜儀測(cè)量引入的不確定度urel(HPLC) 高效液相色譜儀測(cè)量引入的不確定度[12]由計(jì)量檢定機(jī)構(gòu)檢定校準(zhǔn)得來(lái)，日本島津LC-20A型高效液相色譜儀檢定證書(證書編號(hào)：918028710)給出的相對(duì)不確定度為0.002。

3.4 合成相對(duì)不確定度 不確定度各分量分析結(jié)果[13],見表2。

表2 不確定度各分量的相對(duì)不確定度

將表1中不確定度分量合成，得到含量測(cè)定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

因測(cè)得每粒中龍膽苦苷的含量Y=4.57(mg粒)，則合成相對(duì)不確定度uc(Y)=1.93×10-2×4.57=0.088 mg。

3.5 擴(kuò)展不確定度U 測(cè)量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，包含因子k=2，則U=k×uc(Y)=2×0.088=0.18 mg，含量測(cè)定結(jié)果可以表示為：Y=(4.57±0.18)mg(k=2，置信概率為95%)。

4 討論

雖然一切測(cè)量結(jié)果都不可避免具有誤差，且由于測(cè)量誤差的存在，需要對(duì)被測(cè)量值的不能肯定的程度和結(jié)果的可信賴程度進(jìn)行評(píng)定，即不確定度的評(píng)定。不確定度越小，測(cè)結(jié)果與被測(cè)量的真值愈接近，質(zhì)量越高，水平越高，其使用價(jià)值越高；不確定度越大，測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越低，水平越低，其使用價(jià)值也越低。不確定度是測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的重要參數(shù)指標(biāo)。在報(bào)告物理量測(cè)量的結(jié)果時(shí)，必須給出相應(yīng)的不確定度，一方面便于使用它評(píng)定其可靠性，另一方面增強(qiáng)測(cè)量結(jié)果之間的可比性。因此測(cè)量不確定度評(píng)定成為檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室必不可少的工作之一，使用“不確定度”代替“誤差”更為科學(xué)。因此，不確定度在測(cè)量領(lǐng)域內(nèi)越來(lái)越受到社會(huì)重視，被廣泛應(yīng)用。

通過(guò)對(duì)龍膽苦苷含量測(cè)定的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析，列出了檢測(cè)過(guò)程中各影響因素，雖然高效液相色譜法中高效液相色譜儀本身對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響因素就很多[14]，但可以盡量減少影響主要來(lái)自于對(duì)照品稱量的相對(duì)不確定度[15]，同時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，減少不必要的稀釋步驟，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境和條件，定期做好天平、液相色譜儀、玻璃儀器的校驗(yàn)工作，盡量減少不確定度的影響因素，進(jìn)而提高含量測(cè)定結(jié)果的質(zhì)量。