酶法提取余甘子總多酚的研究

王小艷 向宇楠 馮 慧 趙 婭 賴先榮

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

余甘子，為大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實，為常用藏藥，同時具有較高營養(yǎng)價值，位列國家衛(wèi)計委首批藥食同源中藥名單。其含有沒食子酸、鞣花酸等多酚類主要藥用成分，具有降血糖、抗氧化等藥理活性，在糖尿病、肝病等方面發(fā)揮重要作用[1]。因此，藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《藍(lán)琉璃》記載“治尿頻”，《晶珠本草》記載“治赤巴病”[2-3]，在三果湯、十八味訶子利尿丸等藏成藥中應(yīng)用[4-5]。目前，余甘子多采用傳統(tǒng)溶劑提取法[6-7]，以甲醇等有機(jī)溶劑作為提取溶劑，提取溫度過高造成鞣花酸等有效成分活性降低，提取率較低。針對植物細(xì)胞壁是由果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素等構(gòu)成的復(fù)雜致密結(jié)構(gòu)的特點[8-11]，以純化水作為提取溶劑，利用纖維素酶、果膠酶將余甘子細(xì)胞壁中纖維素、果膠質(zhì)等成分降解，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)的目的。該方法提取余甘子總多酚，操作簡單，安全環(huán)保，旨在探索一種新的余甘子總多酚提取方法。

1 儀器與材料

V-1100D型可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；PHS-3S型精密PH計(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)，BSA124S型萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SHA-C恒溫振蕩器(常州澳華儀器有限公司)；福林-酚試劑(濃度2 mol/L ，成都科隆化學(xué)品有限公司，批號：2018042701)；纖維素酶 (酶活力>150U/mg上海源聚生物科技有限公司，批號：171016)，果膠酶(酶活力>50U/mg 上海源聚生物科技有限公司，批號：170925)。沒食子酸對照品(含量≥99%，成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號：DST180226-008)。余甘子藥材(批號：20151101，購自成都市國際商貿(mào)城藥材市場)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)賴先榮教授鑒定為大戟科植物余甘子的干燥成熟果實。其他試劑和藥品均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 福林-酚法測定余甘子總多酚

2.1.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品，精密稱定，置50 mL量瓶中，加30%甲醇使溶解并稀釋至刻度線，搖勻，制成每1 mL含有沒食子酸316 μg的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取余甘子提取液1.0 mL，水浴蒸干，殘渣加30%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加30%甲醇至刻度線，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL，分別至10 mL量瓶中，加30%甲醇至刻度線，得到每1 mL分別含有94.8、110.6 、126.4、142.2、158.0、 173.8 、189.6 μg沒食子酸的溶液。分別吸取以上稀釋后的對照品溶液1.0 mL置25 mL具塞試管中，加5 mL純化水，搖勻，加入1 mL福林-酚試劑，放置5 min，加4 mL14%碳酸鈉溶液，再加純化水至刻度，搖勻，室溫避光放置2 h。同時，以30%甲醇溶液代替對照品溶液為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》四部通則0401)，在754 nm的波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，A=0.0049C-0.1843，R2=0.999，當(dāng)沒食子酸質(zhì)量濃度在94.8～189.6 μg / mL時，吸光度與沒食子酸質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 方法學(xué)考察 取沒食子酸對照品溶液按“2.1.3”項下的方法進(jìn)行配制和測定，重復(fù)測定6次，記錄吸光度(A)，計算其RSD值為2.03%，表明儀器精密度較好。取余甘子提取液按“2.1.2”項下制備6份，同上進(jìn)行測定，記錄A值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，得到平均含量為102.4 mg/g，含量的的RSD值為2.08%，表明方法重復(fù)性良好。將制備的同一供試品溶液于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，進(jìn)行測定，計算得A的RSD值為0.86%，說明供試品溶液12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。參照《中國藥典》2015版第四部9101指導(dǎo)原則，進(jìn)行加樣回收試驗。取9份已知含量的供試品溶液0.15 mL(供試品溶液含5 g藥材，藥液體積150 mL)，分別加入相當(dāng)于余甘子總多酚含量的50%、100%、150%的沒食子酸對照品。同上方法測定，計算加樣回收率，加樣量與結(jié)果見表1，表明加樣回收結(jié)果良好。

2.2 單因素考察試驗

2.2.1 酶的種類和比例的選擇 按照表1所列，精密稱定各組所需酶。取余甘子粗粉5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入各組相應(yīng)的酶，加pH值已調(diào)至4.0的純化水(用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié))100 mL，60℃水浴加熱2 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，并用pH值為4.0的純化水稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率(提取率=余甘子總多酚含量/余甘子粗粉質(zhì)量*100%)。結(jié)果見表2，當(dāng)纖維素酶和果膠酶比例為1∶1時，加酶組3的提取率最高。因此選擇纖維素酶和果膠酶比例為1∶1。

表1 加樣回收率考察

表2 酶的種類、比例及提取率

2.2.2 提取時間對余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5 g，精密稱取，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05 g，再加pH值調(diào)至4.0的純化水100 mL，60℃水浴加熱，加熱時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，各個提取時間對應(yīng)的提取率分別為0.64%、2.66%、2.81%、3.32% 3.86%、3.92%，提取時間在3 h后，提取率趨于穩(wěn)定，表明余甘子的最佳提取時間為3～4 h。

2.2.3 溫度對余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05 g，再加PH值調(diào)至4.0的純化水100 mL，分別置于30℃、40 ℃、50 ℃ 、60℃、70 ℃ 溫度下水浴加熱4 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，各個溫度下的提取率依次為3.60%、3.66%、3.73%、3.80%、3.70%，可以看出無明顯差異。

2.2.4 pH值對余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05 g，再分別加入(用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié))pH值至3.6、4.0、4.5、5.2、5.6、6.2的純化水100 mL，60℃水浴加熱4 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，加入以上相應(yīng)的溶劑至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率依次分別為3.00%、3.30%、3.89%、3.69%、3.61%、3.38%，表明在pH值在4.5左右時，提取率最高。

2.2.5 料液比對余甘子總多酚提取率的影響 取余甘子粗粉5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入纖維素酶、果膠酶各0.05 g，再分別加入已調(diào)至pH值為4.5的純化水50、75、100、150、200、250 mL，60℃水浴加熱4 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率分別為2.80%、4.65%、5.36%、6.97%、8.46%、7.91%，表明當(dāng)料液比為1∶40時，余甘子得到充分提取，總多酚提取率最大。

2.2.6 酶的用量對余甘子總多酚提取率影響 取余甘子粗粉5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入為余甘子粗粉質(zhì)量1%、2%、3%、4%、5%、6% 的酶(纖維素酶：果膠酶=1∶1)，再分別加入已調(diào)至pH值為4.5的純化水200 mL，60℃水浴加熱4 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶，并用以上溶劑稀釋至刻度線。按照“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算余甘子總多酚提取率。結(jié)果，提取率分別8.65%、9.42%、9.28%、9.36%、8.49%、8.39%，表明提取余甘子總多酚的最佳酶用量為2%～4%。

2.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考察各因素之間的相互影響，選用5因素4水平進(jìn)行L16(45)正交實驗，進(jìn)一步確定提取余甘子總多酚提取的最佳條件，因素水平見表3，實驗結(jié)果見表4、極差分析見表5、方差分析見表6。

由表4、5中的極差分析和方差分析可以得出，影響余甘子總多酚提取率的因素的主次D>C>E>B>A 。以溫度A為誤差項進(jìn)行方差分析，因素D料液比對提取效果有顯著影響，因素B、C、E對提取效果無顯著性影響。綜合分析最佳的提取組合為A4 B4 C1D3E2 ，最佳的提取工藝為：提取溫度60℃、提取時間4 h、pH為4.0、料液比為1∶30、酶用量為2%，結(jié)果與單因素考察結(jié)果一致，最佳提取率為10.42%。

表3 因素水平

表4 實驗結(jié)果

表5 極差分析

表6 方差分析

在正交試驗的基礎(chǔ)上，對余甘子進(jìn)行了振蕩提取的初步研究。采用水浴恒溫振蕩器，60℃條件下考察了振蕩轉(zhuǎn)速對余甘子提取結(jié)果的影響。結(jié)果低速(r=60～100/min)條件下，振蕩均勻，提取率為13.5%；中速(r=100～200/min)條件下，振蕩幅度較大，提取率低于低速條件下的提取；高速(r=200～300/min)條件下，振蕩劇烈藥材粗粉大部分粘在容器壁，提取不充分，提取率忽略不計。綜合考慮，選擇低速(r=60～100/min)進(jìn)行驗證實驗。

2.4 驗證實驗 經(jīng)過“2.2”“2.3”的單因素考察和正交實驗可以得出提取余甘子的最佳酶解工藝，現(xiàn)對最佳的工藝條件進(jìn)行驗證。按照以上條件，對加酶組、不加酶組、加酶振蕩組(r=60～100/min)各平行提取3份，進(jìn)行分析比較。結(jié)果見表7。

表7 驗證實驗結(jié)果

由表6可知，各組的余甘子總多酚提取率一致。與未加酶組相比，加酶組的提取率提高了27%，加酶振蕩組提高了64%，加酶振蕩組比加酶組提高了29%?？梢?，加酶組的提取效果較好，加酶振蕩的動態(tài)提取更有利于余甘子總多酚的提取。

3 討論

纖維素酶和果膠酶可以降解植物細(xì)胞中纖維素和果膠質(zhì)等成分，從而破壞植物細(xì)胞壁，發(fā)揮生物催化作用。而酶催化需要特定的溫度和pH環(huán)境。本研究參考了纖維素酶和果膠酶的生物酶提取技術(shù)[12-16]和熱動力學(xué)理論研究[17-19]的相關(guān)文獻(xiàn)，得到纖維素酶和果膠酶提取黃酮類和多酚類成分的最適溫度為30～60 ℃，最適pH值在4～6。在一定溫度范圍內(nèi)，酶的催化效果隨溫度升高而增強，超過一定溫度后，酶的結(jié)構(gòu)被破壞，活性減弱或消失。同時，酶的催化活性也需要在最適的pH值環(huán)境下，過酸或過堿的環(huán)境同樣破壞酶的結(jié)構(gòu)，影響研究結(jié)果。因此，以上討論與研究結(jié)果最終選擇60 ℃、pH值4.0為提取條件相吻合。在本次研究中，余甘子依靠纖維素酶和果膠酶的催化作用，總多酚的提取率有了提高，此外借助水浴恒溫振蕩器的機(jī)械力，使提取溶劑與藥材充分接觸，反復(fù)振蕩使整個過程處于一個小型的動態(tài)循環(huán)之中，進(jìn)一步的促進(jìn)了余甘子總多酚的溶出。

余甘子為藥食同源類中藥，主要含有多酚類化合物，不僅可以發(fā)揮其廣泛的藥理作用，還能發(fā)揮多種營養(yǎng)保健作用，應(yīng)用于食品等領(lǐng)域[20-22]。本次研究中，利用纖維素酶和果膠酶提取主要成分，綠色環(huán)?？墒秤?，希望為余甘子在食品和藥品領(lǐng)域的充分利用發(fā)揮一定的參考價值。