太子參多糖治療大鼠糖尿病足潰瘍研究

王林莉 龐文生 胡 娟,2*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

糖尿病足(diabetic foot) 是糖尿病慢性致殘性并發(fā)癥，又叫糖尿病肢端壞疽；即糖尿病患者合并各種不同程度末梢血管病變和神經(jīng)病變導(dǎo)致下肢感染、潰瘍和/或深部組織破壞[1]。目前全球糖尿病患者高達(dá)4.25億，而中國糖尿病人數(shù)最多，達(dá)1.14億，此外還有3.5億多糖尿病高危人群[2]。糖尿病足部潰瘍，是糖尿病常見嚴(yán)重并發(fā)癥，糖尿病患者患有血管病變、神經(jīng)病變等并發(fā)癥，如周圍神經(jīng)炎、周圍血管病變和膠原異常，導(dǎo)致皮膚創(chuàng)傷難治性，往往發(fā)展為慢性難愈性潰瘍。此即糖尿病患者殘疾，非創(chuàng)傷性下肢截肢的主要原因[3]。

我國古籍中對(duì)糖尿病足的記載始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的《靈樞·癰疽篇》，書中寫到：“發(fā)于足趾，名脫癰。其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死，治之。不衰，急斬之，不則死矣”。宋代竇漢卿《竇氏外科全書·卷二·附甲背發(fā)說》曰：“甲背發(fā)，此癥由消渴之癥發(fā)于手足指，名曰脫疽，其狀赤紫者死，不赤者可治”。清代高秉鈞所著《瘍科心得集》云：脫疽者，足指生疔，重者潰而紫黑，不疼不癢，久則脫去其節(jié)，故名之。亦有患于手指者，名曰蛀節(jié)疔，重者腐去本節(jié)，輕者痙攣。歷代古籍中對(duì)糖尿病足的稱謂有所變化，有脫癰、脫疽等；但都描述出了糖尿病足的病狀及其難愈、致殘致死的特征。

研究表明[4-8]，黃芪多糖、靈芝多糖、白及多糖及天然多糖水凝膠等能促進(jìn)糖尿病足潰瘍的愈合，促進(jìn)潰瘍部位成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原合成。太子參多糖是太子參中具有多種生物活性的一類物大分子物質(zhì)。國內(nèi)外多名學(xué)者的研究表明，太子參多糖具有降血糖、改善糖耐量、促進(jìn)胰島素分泌、保濕、抗衰老、皮膚組織修復(fù)等作用，同時(shí)可提供濕性愈合環(huán)境加速創(chuàng)面愈合[9-11]。因此，研究以大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合率為指標(biāo)，探討太子參多糖治療大鼠糖尿病足潰瘍的藥效，以期為中藥太子參進(jìn)一步開發(fā)和利用提供新的思路。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar雄性大鼠32只，體重180±20 g，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心。大鼠采用單籠喂養(yǎng)，喂養(yǎng)溫度：25 ℃左右，濕度60%左右。大鼠喂食實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料，自由攝食及飲水。

1.2 儀器 中藥材提取罐設(shè)備(武漢中大制藥設(shè)備有限公司)；藥材粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；MOKULYOD-230型冷凍干燥儀(Thermo Fisher公司)；艾科靈銳2血糖測(cè)試儀(艾康生物技術(shù)有限公司)。

1.3 試劑 太子參藥材(福建柘參種業(yè)有限公司)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(北京三藥科技開發(fā)公司)；鏈脲佐菌素(批號(hào)：S0130、SIGMA-ALDRICH公司)；檸檬酸(批號(hào)：15070701、西隴化工股份有限公司)；檸檬酸鈉(批號(hào)：1811291、西隴科學(xué)股份有限公司)；三氯乙醛水合物(批號(hào)：C10323759、MACKLIN)；重組人表皮細(xì)胞生長因子外用溶液(批號(hào)：20190204、深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司)。

1.4 試劑配制方法

①太子參多糖，臨用時(shí)用生理鹽水配制成所需濃度的太子參多糖溶液。2 g太子參多糖，用50 ℃生理鹽水溶解，定容至10 mL；4000 r離心15 min，取上清，制備成0.20 g/mL的太子參多糖溶液。

②10%水合氯醛溶液制備：取5 g水合氯醛，于燒杯中加適量無菌生理鹽水溶解后，定容至50 mL。0.22 μm濾膜過濾后備用。

③枸櫞酸鈉緩沖溶液的配制:檸檬酸(FW：210.14)2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液。檸檬酸鈉(FW：294.10)2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液。用時(shí)將A、B液按1∶1的比例混合，PH計(jì)測(cè)定PH值，調(diào)節(jié)PH=4.2-4.5，0.22 μm濾膜過濾，即是0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液。

④鏈脲佐菌素溶液的配制:以0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液(PH=4.2-4.5)，在4℃條件下，將鏈脲佐菌素配制成1%STZ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 太子參多糖提取 取太子參粉碎(過20目篩)，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入90%乙醇(1∶5，m/v)，室溫下浸泡1 h。80℃加熱，回流提取2次，每次1.5 h。經(jīng)紗布過濾，濾渣揮干乙醇，裝入紗布袋，置于中藥提取罐，按料液比1∶9加入蒸餾水，浸泡1 h，100℃提取2 h后，過濾。重復(fù)提取兩次，合并兩次濾液，減壓蒸發(fā)濃縮至生藥量約0.5 g/mL。濃縮液加入乙醇調(diào)至終濃度為90%乙醇醇沉。4℃環(huán)境下沉淀24 h后，棄去上層乙醇液，-80℃冰箱冷藏后，真空冷凍干燥，得太子參多糖粉末。臨用時(shí)取2 g太子參多糖，用50℃生理鹽水溶解，定容至10 mL；4000 r離心15 min，取上清，制備成0.20 g/mL的太子參多糖溶液。

2.2 大鼠糖尿病足潰瘍模型的制備 4周齡Wistar雄性大鼠32只，體重(180±20)g，清潔級(jí)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后用于實(shí)驗(yàn)。大鼠禁食不禁水12 h后，稱重，尾靜脈采血測(cè)大鼠基礎(chǔ)血糖。隨機(jī)選取24只大鼠，以40 mg/kg的劑量，給予1%STZ溶液左下腹注射，制備大鼠高血糖模型。剩余8只作為空白對(duì)照組，給予等劑量0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液腹腔注射。注射72 h后 連續(xù)3 d監(jiān)測(cè)空腹血糖，依據(jù)《輔助降血糖功能評(píng)價(jià)方法》的標(biāo)準(zhǔn)以血糖值在10～25 mmol/L為高血糖模型成功大鼠。

采用腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g麻醉大鼠后，于大鼠的足背皮膚，用印章作一3 mm×7 mm矩形標(biāo)記，切除全層皮膚，75%酒精棉球消毒創(chuàng)面，形成缺損性足部皮膚潰瘍大鼠模型。

2.3 分組及給藥 32只Wistar雄性大鼠分為4組，其中空白對(duì)照組8只，其余24只高血糖模型大鼠隨機(jī)分為模型組、金因肽外用陽性組、太子參多糖外用組，每組8只?？瞻讓?duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水外用，模型組大鼠給予等體積生理鹽水外用，金因肽外用陽性組大鼠給予重組人表皮細(xì)胞生長因子外用溶液局部均勻噴濕創(chuàng)面，每日1次，約4000 IU/10×10 cm2，太子參多糖外用組大鼠足潰瘍創(chuàng)面給予太子參多糖外涂，每天2次。

2.4 大鼠糖尿病及糖尿病足潰瘍模型指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 血糖 測(cè)定大鼠連續(xù)給藥周期內(nèi)監(jiān)測(cè)其空腹血糖的變化情況，每隔7 d，各組均禁食不禁水6 h，尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定空腹血糖值。

2.4.2 大鼠體征的觀察及體重測(cè)定 觀察大鼠是否出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀。連續(xù)給藥周期內(nèi)，每隔7 d監(jiān)測(cè)一次體重并進(jìn)行記錄。

2.4.3 大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面監(jiān)測(cè) 觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合的情況，每隔7 d對(duì)大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合情況進(jìn)行拍照記錄。采用Image-pro plus圖像處理分析軟件獲取JPEG格式圖像數(shù)據(jù)，評(píng)估創(chuàng)面愈合情況。使用顏色及對(duì)比度濾鏡增強(qiáng)圖像后，依據(jù)創(chuàng)面呈紅色與背景膚色的區(qū)別，選取紅色創(chuàng)面為測(cè)量區(qū)域，測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面總面積-未愈創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面總面積×100%

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體征的觀察及體重測(cè)定 造模組大鼠體型消瘦，倦怠乏力，毛發(fā)黯淡發(fā)灰，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀。

3.2 大鼠空腹血糖結(jié)果 大鼠連續(xù)給藥后第7 d及第14 d，各組均禁食不禁水 6 h后，尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定大鼠空腹血糖值。由表1可見，造模后治療前即0 d，空白對(duì)照組大鼠平均血糖(4.43±0.52)處于正常水平，但模型對(duì)照組大鼠平均血糖(16.94±4.09)，證明高血糖大鼠造模成功。太子參多糖外用治療大鼠足潰瘍7day和14day，空白對(duì)照組大鼠平均血糖分別為(4.46±0.50)和(4.59±0.43)均處于正常水平；但模型組、陽性對(duì)照組、太子參多糖治療組大鼠血糖一直維持在(18.96±6.13)～(23.48±5.13)較高水平；給藥周期內(nèi)，高血糖大鼠血糖值仍然處于較高水平，即外用金因肽和太子參粗多糖并不能降低高血糖大鼠血糖值，同時(shí)高血糖大鼠血糖值也無自然恢復(fù)。

組別0d7d14d空白組4.43±0.524.46±0.504.59±0.43模型組16.94±4.0918.96±6.1322.23±4.45金因肽外用陽性組19.36±3.9322.63±7.7823.61±3.43太子參粗多糖外用組17.71±3.1322.58±4.9223.48±5.13

3.3 大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合結(jié)果 由圖1可知，造足部潰瘍模型后，各組大鼠潰瘍創(chuàng)面鮮紅，可見明顯的炎性膿液滲出。造模后第7 d，空白組創(chuàng)面結(jié)痂脫落，傷痕收縮紅活；模型組創(chuàng)面結(jié)成黃褐色痂，且創(chuàng)面仍有稀薄膿性分泌物；陽性組和多糖外用組創(chuàng)面結(jié)成紅褐色痂，創(chuàng)面收縮。造足部潰瘍模型后第14 d，空白組創(chuàng)面全部愈合，足部留有淡淡的傷痕；陽性組創(chuàng)面大多愈合，創(chuàng)面有干燥皮屑脫落；多糖外用組創(chuàng)面基本愈合，少有一點(diǎn)黑星小痂；模型組創(chuàng)面大都留有紅褐色結(jié)痂。采用Image-pro plus圖像處理分析軟件計(jì)算各組大鼠創(chuàng)面愈合率，由表2、圖2可知，給藥后第14 d，各組大鼠創(chuàng)面基本愈合。給藥周期內(nèi)各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的效果為，空白組好于金因肽外用陽性組、好于太子參多糖外用組好于模型組。造足部潰瘍模型后，空白組的正常動(dòng)物創(chuàng)面結(jié)痂和愈合速度明顯快于糖尿病動(dòng)物，表明高血糖影響大鼠足潰瘍創(chuàng)面的愈合。太子參多糖外用組及陽性組結(jié)痂和愈合速度明顯快于模型組，與模型組相比，差異具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明了太子參多糖具有促進(jìn)高血糖大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的藥效。

組別例數(shù)Day7Day14空白組879.82%±0.05**100.00%±0.00**模型組847.34%±0.1388.33%±0.07金因肽外用陽性組868.32%±0.11**△99.90%±0.003**△20%太子參粗多糖外用組865.13%±0.09**△98.62%±0.02**△

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；陽性對(duì)照與治療組相比，△P>0.05。

4 討論

糖尿病可引起神經(jīng)和血管損傷，持續(xù)高血糖可導(dǎo)致基于周圍神經(jīng)病變的全身性多部位神經(jīng)損傷，使糖尿病患者肢端缺血和對(duì)傷痛的感覺不靈敏，增加了糖尿病足潰瘍這一并發(fā)癥出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。持續(xù)高血糖會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致促血管生成信號(hào)和一氧化氮生成減少。此外，高血糖患者白細(xì)胞功能受損，免疫功能受損，相關(guān)部位免疫應(yīng)答不足，使糖尿病足這一糖尿病常見并發(fā)癥更難愈合[12]。

實(shí)驗(yàn)型糖尿病足潰瘍動(dòng)物模型的制備多是在糖尿病模型的基礎(chǔ)上配合外部干預(yù)建立的。鏈脲佐菌素這一藥物對(duì)哺乳動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有特異毒性，造成胰島素分泌低下，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病，此藥物性糖尿病模型制備操作簡便，成模周期短，被廣泛用于誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型。鏈脲佐菌素的注射劑量是決定糖尿病模型成功與否的關(guān)鍵，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg以上劑量，大鼠胰島細(xì)胞大量被破壞，血糖迅速升高，極容易造成死鼠，不利于對(duì)糖尿病進(jìn)一步研究；40 mg/kg以下劑量造模血糖上升趨勢(shì)緩慢，成模率低，其可能處于胰島素抵抗早期，胰島β細(xì)胞為代償胰島素抵抗而分泌更多的胰島素進(jìn)而控制血糖上升。本實(shí)驗(yàn)以40 mg/kg的劑量，給予1%STZ溶液左下腹注射，制備大鼠高血糖模型。造模后大鼠血糖一直維持在較高水平[(16.94±4.09)～(23.61±3.43)]，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀，符合臨床糖尿病患者的病癥特征；進(jìn)而于高血糖大鼠足背部切除一矩形全層皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型[13]。

目前難治性糖尿病足潰瘍還沒有理想的特效藥，植物多糖具有皮膚組織修復(fù)等作用，同時(shí)可提供濕性愈合環(huán)境加速創(chuàng)面愈合。本文通過空白組、模型組、金因肽外用陽性組、太子參多糖外用組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合率的對(duì)比，證明了太子參多糖具有促進(jìn)高血糖大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的藥效，為中藥太子參進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了新的思路。