牦牛肌鈣蛋白I基因家族的克隆及組織表達(dá)分析

向 婭,柴志欣,王吉坤,信金偉,王 會(huì), 王嘉博,武志娟,鐘金城,姬秋梅

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041； 2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西藏 拉薩 850000)

肌鈣蛋白(Troponin, Tn)是位于肌纖維蛋白細(xì)絲中的結(jié)構(gòu)蛋白[1],也是一種與心臟和骨骼肌收縮相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白,能夠影響家畜的肉質(zhì)性狀[2]。Tn可調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間的相互作用,由肌鈣蛋白C(TnC)、肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白I(TnI)3個(gè)亞基組成。TnI是肌鈣蛋白-原肌球蛋白調(diào)節(jié)復(fù)合物中的抑制性亞單位,可結(jié)合到肌動(dòng)蛋白,阻止其與肌球蛋白的頭部接觸,也可抑制肌球蛋白酸的活性,使心肌和骨骼肌保持松弛狀態(tài)[3]。TNNI 家族包括TNNI1、TNNI2和TNNI33種亞型,其表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育調(diào)控模式[4]。楊華[5]研究表明,緩慢收縮的骨骼肌類型TnI(TNNI1)早期在心肌、慢收縮性骨骼肌纖維發(fā)育過程中均存在表達(dá),但個(gè)體成年后,在慢收縮骨骼肌纖維中特異性表達(dá)；快收縮骨骼肌型TnI(TNNI2)在快速收縮的骨骼肌纖維中表達(dá)；心臟型TnI(TNNI3)是心肌表達(dá)的特異性基因。另外,在早期骨骼肌形成期間,TNNI1和TNNI2共同表達(dá),但隨著骨骼肌不斷發(fā)育和成熟,TNNI1和TNNI2分別定向表達(dá)于骨骼肌慢肌纖維和快肌纖維。此外,TNNI1在氧化肌肉纖維中表達(dá),常作為模型基因用于研究慢肌纖維的特異性表達(dá)機(jī)制[6-8]。

在人和鼠胚胎、胎兒期,TNNI1和TNNI3均能在心肌層表達(dá),TNNI1的表達(dá)占主導(dǎo)地位[9]。個(gè)體出生后,TNNI3表達(dá)上調(diào),TNNI1的表達(dá)下調(diào)。相關(guān)研究表明,TNNI1mRNA和TNNI3mRNA可通過RNA印跡在14～21日齡的大鼠心臟中檢測(cè)到[10],但在出生后9個(gè)月的人心肌中僅能檢測(cè)出TNNI3mRNA[11]。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明,肌鈣蛋白I基因家族與疾病密切相關(guān)。TNNI2蛋白是一種抑制血管生成活性和腫瘤轉(zhuǎn)移的強(qiáng)特異性因子,且無明顯的毒性作用[12]。與其他血管生成抑制因子相比,TNNI2蛋白具有更強(qiáng)的抑制活性。TNNI3基因異常與常見的3種遺傳性心肌病有關(guān),該基因序列中不同位點(diǎn)突變均可引起不同類型的心肌疾病,如擴(kuò)張性心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)由1處突變引起,限制性心肌病(Restrictive cardiomyopathy,RCM)由6處突變導(dǎo)致,肥厚性心肌病(Hypertrophicca cardiomyopathy,HCM)與26處突變有關(guān)[13]。此外,趙秀麗[14]研究發(fā)現(xiàn),遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲、弗里曼-謝爾登綜合征(DA2A)、謝爾登·霍爾綜合征(DA2B)及面部痙攣均由TNNI2位點(diǎn)突變導(dǎo)致,表明TNNI2對(duì)人骨骼和肌肉發(fā)育發(fā)揮重要作用,同時(shí),TNNI1、TNNI2在家畜肌肉脂肪沉積過程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用[15-17]。TNNI1和TNNI3基因通過影響肌纖維直徑直接影響肉質(zhì)的嫩度[18]。

牦牛作為青藏高原農(nóng)牧民主要的生產(chǎn)生活來源,是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展不可缺少的重要畜種[19],深入研究牦牛肌鈣蛋白的生物學(xué)特性及分子調(diào)控機(jī)制對(duì)高原畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究通過克隆類烏齊牦牛肌鈣蛋白I基因家族的CDS區(qū)序列,運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究其在牦牛不同組織中的表達(dá)情況,旨在從分子水平初步分析肌鈣蛋白I基因家族各成員的生物學(xué)特性,為深入研究其調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣0.5歲健康的類烏齊牦牛3頭。屠宰后,迅速采集臀肌、心臟、肝臟、肺臟等組織樣品,DEPC水沖洗干凈后,用錫箔紙包裝,迅速儲(chǔ)存在液氮中。

TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司,DNA 聚合酶和dNTPs購(gòu)自Thermo Scientific 公司,RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time))、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2 000 bp Marker、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；分析純氯仿、異丙醇、無水乙醇均購(gòu)自濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取組織總RNA及cDNA合成 用TRIzol法提取各組織的總RNA,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量,NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及D260nm/280nm值。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上牛TNNI1、TNNI2和TNNI3基因序列,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物；基于得到的類烏齊牦牛TNNI基因家族CDS區(qū)序列及牦牛GAPDH基因序列設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物(表1)。引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 肌鈣蛋白Ⅰ基因家族引物序列信息Tab.1 Troponin Ⅰ gene family primer sequence information

1.2.3 牦牛TNNI基因家族的克隆 以合成的cDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系(25 μL):上下游引物各1 μL,cDNA模板1 μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,57.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸35 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min,4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,確認(rèn)產(chǎn)物目的條帶是所需的目的片段大小后,參照DNA純化回收試劑盒說明書,回收PCR產(chǎn)物,儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

按照pGEM-T載體試劑盒說明書進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇后,均勻涂布在含Amp+的LB固體培養(yǎng)基表面,37 ℃倒置培養(yǎng)10～12 h；挑取白色單克隆菌落,篩選陽(yáng)性菌液,送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 牦牛TNNI基因家族的生物信息學(xué)分析 對(duì)類烏齊牦牛TNNI基因家族的CDS區(qū)進(jìn)行序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)(表2)。

表2 DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具Tab.2 DNA and protein sequence data analysis tools

1.2.5 牦牛TNNI基因家族的組織表達(dá)量檢測(cè) 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)肌鈣蛋白I家族及內(nèi)參基因GAPDH的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物(表1)。反應(yīng)體系(10 μL):TB Green Premix ExTaqⅡ(2×)5 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 模板1.0 μL、無RNAase 水3.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s,56 ℃退火30 s,65 ℃延伸5 s,共39 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù),3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以牦牛GAPDH為內(nèi)參基因?qū)M織進(jìn)行定量結(jié)果分析,以溶解曲線來判定RT-qPCR 反應(yīng)產(chǎn)物的特異性,得到每個(gè)樣品的Ct值,利用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛TNNI基因家族PCR擴(kuò)增結(jié)果

以類烏齊牦牛臀肌組織cDNA為模板,擴(kuò)增肌鈣蛋白Ⅰ基因家族CDS區(qū),經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得與預(yù)期牦牛TNNI1、TNNI2和TNNI3基因片段大小一致的單一清晰條帶,大小分別為595,666,739 bp(圖1)。

測(cè)序校對(duì)獲得牦牛肌鈣蛋白I基因家族TNNI1、TNNI2和TNNI3基因CDS區(qū)大小分別為564,549,639 bp,分別編碼187,182,212個(gè)氨基酸殘基(圖2)。

M1.DNA Marker DL750；M2.DNA Marker DL2000；1-3.TNNI1、TNNI2和TNNI3基因。 M1.DNA Marker DL750；M2.DNA Marker DL2000；1-3.TNNI1，TNNI2 and TNNI3 genes,respectively.

A-C.TNNI1、TNNI2和TNNI3基因。 A-C.TNNI1,TNNI2 and TNNI3 genes,respectively.

2.2 牦牛TNNI基因家族序列比對(duì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載9個(gè)不同物種的肌鈣蛋白I基因家族氨基酸序列,利用MegAlign軟件對(duì)TNNI1、TNNI2和TNNI3基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示,牦牛肌鈣蛋白I基因家族在哺乳動(dòng)物間高度保守(表3)。

2.3 牦牛TNNI基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Mega 7.0軟件對(duì)類烏齊牦牛、黃牛、水牛、人、小鼠、綿羊、黑猩猩、野豬、雞和熱帶爪蟾的肌鈣蛋白I基因家族氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明,牦牛TNNI1基因與水牛的親緣關(guān)系最密切,其次是綿羊,然后是黃牛,與野豬、人、黑猩猩等親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而TNNI2、TNNI3基因首先與黃牛聚在一起,其次是水牛,與其他親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3-5)。

表3 牦牛肌鈣蛋白I基因家族與 其他物種序列相似性比對(duì)分析Tab.3 Sequence homology analysis of yak troponin I gene family and other species %

2.4 牦牛TNNI基因家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

2.4.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用在線軟件ExPASy-ProtParam程序?qū)﹃笈＜♀}蛋白I基因家族蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表4可知,TNNI基因家族的蛋白等電點(diǎn)均大于 7,為偏堿性蛋白；TNNI1、TNNI2和TNNI3蛋白氨基酸出現(xiàn)頻率最高的分別是賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg),最低的均是色氨酸(Trp)；不穩(wěn)定指數(shù)均大于40,說明TNNI家族蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)均大于60,說明TNNI基因家族蛋白流動(dòng)性好。

2.4.2 疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè) 利用在線軟件ExPASy-ProtScale對(duì)牦牛肌鈣蛋白I基因家族的氨基酸序列進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)。牦牛TNNI基因家族蛋白中大多數(shù)氨基酸是親水性的,結(jié)合ExPASy-ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果,TNNI1、TNNI2和TNNI3 蛋白均為親水性蛋白。ExPASy-TMHMM 2.0預(yù)測(cè)表明TNNI1、TNNI2和TNNI3都不是跨膜蛋白。SignalP 4.1預(yù)測(cè)牦牛TNNI基因家族蛋白的信號(hào)肽位點(diǎn),結(jié)果顯示,TNNI基因家族蛋白沒有信號(hào)肽,均為非分泌型蛋白。

圖3 TNNI1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TNNI1

圖4 TNNI2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TNNI2

圖5 TNNI3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of TNNI3

2.4.3 磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的翻譯后修飾方式[20],蛋白質(zhì)的磷酸化主要集中在肽鏈中的Tyr、Ser、Thr殘基上。利用在線軟件NetPhos 3.1預(yù)測(cè)牦牛肌鈣蛋白I基因家族氨基酸上的磷酸化位點(diǎn),顯示閾值為0.5時(shí),TNNI1蛋白有13個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中包括9個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；TNNI2蛋白預(yù)測(cè)到14個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中Ser磷酸化位點(diǎn)為7個(gè),Thr磷酸化位點(diǎn)為5個(gè),Tyr磷酸化位點(diǎn)為2個(gè)；TNNI3蛋白存在17個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中Ser磷酸化位點(diǎn)為10個(gè)(Ser24、Ser79、Ser152等),Thr磷酸化位點(diǎn)為6個(gè),Tyr磷酸化位點(diǎn)為1個(gè)。

表4 牦牛肌鈣蛋白Ⅰ家族蛋白的基本性質(zhì)Tab.4 Basic properties of yak troponin Ⅰ gene family proteins

蛋白質(zhì)中有2種類型的糖基化位點(diǎn),即N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)；Asn氨基上主要含N-糖基化位點(diǎn),O-糖基化位點(diǎn)則主要存在于Ser和Thr的羥基上[21-22]。分別利用在線軟件ExPASy中NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0進(jìn)行O、N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。分析結(jié)果表明,TNNI1蛋白存在5個(gè)O-糖基化位點(diǎn),未檢測(cè)到N-糖基化位點(diǎn)；TNNI2蛋白含有3個(gè)O-糖基化位點(diǎn),未檢測(cè)到N-糖基化位點(diǎn)；TNNI3蛋白存在13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(其中包括第152位)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。

2.4.4 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域是在蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)中,具有特殊遺傳來源和功能的結(jié)構(gòu)域[23-24]。利用NCBI-CD Search對(duì)牦牛肌鈣蛋白I基因家族的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6-8)。結(jié)果表明,TNNI1、TNNI2和TNNI3基因編碼蛋白均含有肌鈣蛋白超家族(Troponin superfamily)保守結(jié)構(gòu)域；且TNNI3在1-32位含有肌鈣蛋白I_N端超家族(Troponin-I_N superfamily)保守結(jié)構(gòu)域,該超家族代表肌鈣蛋白I的心臟N-端延伸,蛋白質(zhì)的這個(gè)區(qū)域(1-32)可與cTnC的N-端相互作用,調(diào)節(jié)肌絲Ca2+的敏感性[25]。

圖6 牦牛TNNI1基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Conserved domain prediction of yak TNNI1 gene encoding protein

圖7 牦牛TNNI2基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.7 Conserved domain prediction of yak TNNI2 gene encoding protein

圖8 牦牛TNNI3基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.8 Conserved domain prediction of yak TNNI3 gene encoding protein

2.4.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用在線軟件ExPASy-SOPMA預(yù)測(cè)牦牛肌鈣蛋白I基因家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(表5), TNNI1與TNNI3均由α-螺旋(Alpha helix)、無規(guī)則卷曲(Random coil)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和延伸鏈(Extended strand)構(gòu)成,且都以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主；而TNNI2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主,還有少量的無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角。

利用在線軟件ExPASy-SWISS-MODEL,基于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)牦牛肌鈣蛋白I基因家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖9)。結(jié)果顯示,牦牛TNNI家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主,TNNI2蛋白還含有少量的無規(guī)則卷曲。

表5 牦牛TNNI基因家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab.5 Secondary structure prediction of yak TNNI gene family proteins %

A-C.TNNI1、TNNI2、TNNI3蛋白。 A-C.TNNI1,TNNI2 and TNNI3 proteins.

2.5 牦牛TNNI基因家族組織表達(dá)量分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)TNNI家族各個(gè)基因進(jìn)行不同組織間的差異表達(dá)分析,結(jié)合SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析(表6)。結(jié)果顯示,在不同組織間,TNNI1基因的mRNA在臀肌、心臟中的表達(dá)量顯著高于肺臟和肝臟(P<0.05)；TNNI2基因在臀肌中的表達(dá)量顯著高于心臟、肝臟和肺臟(P<0.05)；而TNNI3基因在心臟中表達(dá)量較高,而在肺臟、臀肌和肝臟中少量表達(dá)。在不同的基因中,TNNI1和TNNI2在臀肌中的表達(dá)量顯著高于TNNI3(P<0.05),TNNI1在心臟、肝臟和肺臟中的表達(dá)量顯著高于TNNI2(P<0.05),3個(gè)基因在肝臟中均有不同程度的表達(dá),具體表現(xiàn)為TNNI1>TNNI2>TNNI3。

表6 牦牛肌鈣蛋白Ⅰ家族基因在不同組織中的mRNA表達(dá)量Tab.6 mRNA expression of yak troponin Ⅰ family genes in different tissues

注:同行不同小寫字母表示組織間差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示基因間差異顯著(P<0.05)。

Note:The different lowercase letters of the peer indicate significant difference among different tissues(P<0.05)；The different uppercase letters in the same column indicate significant difference among different genes(P<0.05).

3 討論與結(jié)論

目前,人類[6-7,26]、鴨[27]、豬[5]、羊[20,28]等多個(gè)物種的肌鈣蛋白基因已被成功克隆,但對(duì)牦牛肌鈣蛋白I基因家族的研究相對(duì)較少,本研究進(jìn)行了牦牛肌鈣蛋白I基因家族的克隆、生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)分析。序列同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹在一定程度上反映了物種間的遺傳關(guān)系[29]。通過對(duì)比類烏齊牦牛、黃牛、水牛、人、小鼠、綿羊、黑猩猩、野豬、雞和熱帶爪蟾的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)牦牛肌鈣蛋白I家族基因在哺乳動(dòng)物間具有高度的保守性,表明TNNI 家族基因在Ca2+調(diào)控的心肌和骨骼肌收縮中具有功能性的保守性[5]。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明,牦牛TNNI1基因先與水牛聚到一類,其次是綿羊,然后是黃牛,而TNNI2、TNNI3基因則與黃牛和水牛親緣關(guān)系較近,與其他親緣關(guān)系較遠(yuǎn),綜合說明，類烏齊牦牛TNNI基因家族與水牛和黃牛的親緣關(guān)系較近。

谷氨酸在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用,參與動(dòng)物、植物和微生物中多種重要化學(xué)反應(yīng),同時(shí)是重要的鮮味劑,對(duì)香味具有增強(qiáng)作用。本研究顯示牦牛TNNI 家族蛋白谷氨酸含量為11.20%,13.70%,9.40%,谷氨酸含量越高,肉品質(zhì)越好,且易消化吸收。膠原蛋白是人體骨骼,尤其是軟骨組織中的重要組成成分,只有攝入足夠的膠原蛋白,鈣才能更快地被人體消化吸收,并迅速到達(dá)骨骼部位進(jìn)行沉積[30-32]。膠原蛋白的水解產(chǎn)物含有多種氨基酸,其中甘氨酸(Gly)含量最高,動(dòng)物組織是人們獲取天然膠原蛋白的主要途徑,本研究顯示,類烏齊牦牛TNNI 蛋白甘氨酸含量為3.2%,4.4%,6.1%,表明類烏齊牦牛是一個(gè)潛在的膠原蛋白源。跨膜蛋白基于多肽鏈以α-螺旋構(gòu)象通過磷脂雙層的次數(shù),可分為單次和多次跨膜蛋白[23],且根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性,也可幫助預(yù)測(cè)蛋白是否為跨膜螺旋。牦牛TNNI基因家族蛋白質(zhì)中大多數(shù)氨基酸均屬親水性的,表明它們?cè)谀?nèi)側(cè)不穩(wěn)定,不利于形成跨膜蛋白,可推測(cè)TNNI1、TNNI2和TNNI3均不是跨膜蛋白,與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在調(diào)節(jié)TNNI 家族基因的結(jié)構(gòu)和功能中起主要作用[33]。絲氨酸磷酸化主要是變構(gòu)蛋白質(zhì),影響蛋白質(zhì)的生理活性和功能,這可能是TNNI蛋白在磷酸化過程中,改變構(gòu)象和酶活性的原因。酪氨酸磷酸化則會(huì)促使蛋白質(zhì)亞基的聚合,形成多蛋白復(fù)合體,是肌鈣蛋白復(fù)合物行使功能的主要結(jié)構(gòu)亞基[28]。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)到TNNI1 蛋白有13個(gè)磷酸化位點(diǎn),TNNI2 蛋白有14個(gè)磷酸化位點(diǎn),TNNI3 蛋白有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)。TNNI3 的磷酸化位點(diǎn)與其對(duì)心肌的收縮調(diào)節(jié)有關(guān),當(dāng)體內(nèi)腎上腺素水平升高時(shí),細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶使TNNI3 蛋白磷酸化,從而調(diào)節(jié)心臟的收縮[28]。TNNI3是細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的底物,對(duì)μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶具有敏感性,通過μ-鈣蛋白酶的降解調(diào)控TNNI3的磷酸化,其中PKA的磷酸化降低了靈敏度,而PKC的磷酸化增加了對(duì)μ-鈣蛋白酶蛋白水解的敏感性[34]。在小鼠心臟中,PKC-βⅡ?qū)NNI3的Thr 143的磷酸化增加了肌絲Ca2+的敏感性[35]；但另一研究觀察到Thr 143磷酸化不會(huì)改變Ca2+敏感性,而是會(huì)抑制細(xì)絲的協(xié)同激活[36]。本研究發(fā)現(xiàn) TNNI3 Ser 152既是磷酸化位點(diǎn),也是糖基化位點(diǎn),該位點(diǎn)的糖基化與心肌型肌鈣蛋白I對(duì)Ca2+敏感性有關(guān)[37]。由于AMPK是細(xì)胞能量學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,Ser 152的磷酸化可能與心臟和骨骼肌能量剝奪的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)。TNNI3蛋白有2個(gè)位點(diǎn)為半胱氨酸,易發(fā)生氧化或還原反應(yīng),這類反應(yīng)可影響TNNI3蛋白的分子結(jié)構(gòu)和抗原性,從而影響某些抗體的識(shí)別能力。

與TNNI1、TNNI2相比,類烏齊牦牛的TNNI3蛋白的N端延伸出32個(gè)氨基酸殘基。成人心臟中TNNI3的特異性N末端延伸是一種調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu),N末端延伸包含關(guān)鍵的PKA磷酸化位點(diǎn),并在調(diào)節(jié)TNNI3的整體分子構(gòu)象和功能中起作用[38]。相關(guān)研究表明,TNNI3的N末端延伸是針對(duì)舒張性心力衰竭靶向治療的潛在位點(diǎn)[39]。本研究中二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,牦牛肌鈣蛋白I家族基因蛋白都是α-螺旋為主,這有助于肌肉纖維肥大,從而有利于動(dòng)物軀體肌肉增大、增粗[40]；且含有較高的無規(guī)則卷曲和一定比例的β-轉(zhuǎn)角,無規(guī)則卷曲被認(rèn)為是構(gòu)成酶活性部位以及其他功能部位的前提條件[20],TNNI1、TNNI2和TNNI3 3個(gè)蛋白的無規(guī)卷曲含量都較高,表明他們具有形成功能部位的條件。TNNI1和TNNI3還含有少量的延長(zhǎng)鏈,而TNNI2沒有延長(zhǎng)鏈,這可能與其功能相關(guān)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,TNNI1基因在各組織中均有表達(dá),依次為臀肌、心臟、肺臟、肝臟,與Yang等[41]發(fā)現(xiàn)TNNI1在豬小腸、腎臟組織中的表達(dá)量最高,都顯著高于心臟；Sun 等[42]發(fā)現(xiàn)TNNI1在羊心臟中的表達(dá)量顯著高于肌肉組織,而在肺臟、肝臟、腎臟中的表達(dá)量很低的研究結(jié)果存在一定差異,說明TNNI1基因的組織表達(dá)具有物種特異性；也可能是因?yàn)轭悶觚R牦牛常年放養(yǎng)于海拔3 700 m以上的草甸草原地區(qū),耐粗、耐勞、耐寒,其骨骼肌較為發(fā)達(dá),以適應(yīng)高寒生態(tài)環(huán)境,故臀肌等骨骼肌肌纖維含量非常豐富。TNNI2基因在臀肌中的表達(dá)量顯著高于心臟、肝臟和肺臟(P<0.05),與吳婷婷[20]、張陽(yáng)[28]的研究結(jié)果相符。有研究報(bào)道,TNNI2在小鼠血管中的平滑肌細(xì)胞中顯著表達(dá)[43],在主動(dòng)脈、膀胱、支氣管的平滑肌中也會(huì)表達(dá)[44],但總體而言,TNNI2主要表達(dá)在快肌纖維中。TNNI3基因在牦牛的心臟中高表達(dá),在肺臟中微量表達(dá),在臀肌和肝臟中幾乎不表達(dá),說明TNNI3基因具有心臟表達(dá)特異性,這與Dhoot等[45]發(fā)表的人TNNI3基因只在心肌內(nèi)表達(dá)大致相符。

本研究首次克隆獲得牦牛肌鈣蛋白Ⅰ基因家族的CDS區(qū)序列,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，牦牛TNNI家族與黃牛、水牛的親緣關(guān)系最近,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，TNNI1和TNNI2在臀肌中的表達(dá)量最高,TNNI3在心臟中特異性表達(dá),為研究肌鈣蛋白Ⅰ基因家族在調(diào)控牦牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、致病機(jī)理方面提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。