基于pH響應(yīng)兩親性卟啉嵌段共聚物的光動力與化學(xué)聯(lián)合治療

肖 潮， 田 佳， 劉 峰， 張顯楊， 王廷虎， 許立人， 顧邯沙， 張偉安

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237）

近年來癌癥的發(fā)病率不斷上升，由于沒有特別有效的治愈方法，死亡率一直居高不下[1]。光動力療法（PDT）被希冀于成為一種有效的癌癥治療手段，該療法是通過先將光敏劑（PS）聚集在腫瘤部位，然后PS在相應(yīng)的激光照射下，產(chǎn)生高能量的活性氧（ROS），從而殺死癌細(xì)胞[2-4]。相比化療、激光治療和手術(shù)切除等目前常用的治療方法，PDT具有可控、局部定位、副作用小、治療徹底等優(yōu)勢[5-7]。一些光敏劑目前已經(jīng)得到美國食品藥品局(FDA)的認(rèn)可，其中基于維替泊芬（Verteporfin）的藥劑維速達(dá)爾已經(jīng)大量用于治療黃褐斑與病理性近視[8]。四苯基卟啉（TPP）作為第一代光敏劑，近年來一直是PDT的熱點研究對象，但其單線態(tài)氧產(chǎn)率不高、靶向性差、小分子水溶性差、化學(xué)修飾困難、生物相容性差和易聚集引起猝滅等缺點一直是阻礙其發(fā)展和臨床應(yīng)用的難點[9-15]?，F(xiàn)階段最常用的方式是直接將卟啉物理包封或包覆在一個納米藥物運送系統(tǒng)中，然后借助于大分子納米顆粒的生物相容性、實體瘤的高通透性和滯留（EPR）效應(yīng)等優(yōu)點，將卟啉運送到腫瘤部位，再在腫瘤部位進(jìn)行光照，從而實現(xiàn)腫瘤部位的局部治療[16-23]。Li等[24]將四苯基卟啉摻雜在以聚（苯乙烯-馬來酸酐）和聚[（9,9-二辛基芴-2,7-二基）-交替-（2,2'-聯(lián)二噻吩-5,5'-二基）]制成的納米量子點中，然后以聚合物的納米量子點為載體，以解決其生物相容性差、化學(xué)修飾困難等缺點，實現(xiàn)了較好的腫瘤治療效果。Roy等[25]將三乙氧基乙烯基硅烷水解制成尺寸為30 nm左右的二氧化硅納米顆粒，并將卟啉直接物理包封其中，通過EPR效應(yīng)，二氧化硅納米顆?？梢詫⑦策\載到腫瘤部位，以解決其在水溶液中易聚集、生物相容性差、化學(xué)修飾困難等缺點。Ding等[26]則合成了兩種特殊的卟啉分子，將其直接制成尺寸合適的納米顆粒，以解決卟啉水溶性差、易聚集的缺點；并利用EPR效應(yīng)，使納米顆粒在腫瘤處聚集，從而實現(xiàn)了較好的腫瘤治療效果[26]。以上通過物理包載的方式將TPP運送到腫瘤部位的方法，雖然解決了卟啉的一些固有缺點，但依舊存在一些不足之處：（1）小分子卟啉在腫瘤細(xì)胞處釋放出來后，依舊十分容易聚集猝滅，導(dǎo)致單線態(tài)氧產(chǎn)率的降低；（2）卟啉只是簡單地物理包載在納米顆粒內(nèi)部，在生物體內(nèi)長循環(huán)時容易泄露，從而使得腫瘤部位的卟啉量降低[27]。因此，構(gòu)建具有腫瘤內(nèi)源性響應(yīng)的雙親性的卟啉聚合物不僅能夠解決藥物提前泄露問題，還能減少卟啉堆積引起的自淬滅現(xiàn)象。

本文結(jié)合可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合與點擊化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建了一種兩親性嵌段共聚物聚乙二醇-聚甲基丙烯酸二異丙基氨基乙酯-四苯基卟啉（PEG-PDPA-TPP），該共聚物的中間連接點上有一個可用作光動力療法中光敏劑的四苯基卟啉（TPP）基元。首先通過RAFT聚合制備了中間節(jié)點為疊氮的雙親性聚合物PEG-PDPA-N3和帶有炔基官能團(tuán)的TPP，然后利用點擊化學(xué)將TPP偶聯(lián)到親水段與疏水段的連接點上。這種兩親性的嵌段共聚物由親水性的聚乙二醇（PEG）嵌段、疏水性的聚甲基丙烯酸二異丙基氨基乙酯（PDPA）嵌段和連接點上的TPP組成。卟啉通過共價化學(xué)鍵相連在大分子PEGPDPA上，使得TPP能夠穩(wěn)定地固定在納米顆粒內(nèi)，從而解決其在生物體內(nèi)長循環(huán)時易泄露的問題。并且PEG-PDPA-TPP在水溶液中組裝形成包載鹽酸阿霉素（DOX）的納米膠束，可進(jìn)一步與化療聯(lián)合治療癌癥。因此PEG-PDPA-TPP不僅是修飾了TPP的大分子光敏劑，同時也是化療藥物DOX極佳的運載和釋放載體，能夠在癌細(xì)胞內(nèi)的酸性條件下釋放出DOX。最重要的是，通過分子設(shè)計將TPP單元偶聯(lián)在親水段和疏水段中間點使得TPP在疏水和親水組分之間規(guī)則排列而不是聚集在一起，從而解決了卟啉聚集引起的單線態(tài)氧產(chǎn)率下降的問題，提高了大分子光敏劑PEG-PDPA-TPP的光動力效果。因此，這種裝載DOX的基于pH響應(yīng)的含TPP嵌段共聚物的藥物釋放平臺能夠解決卟啉在生物癌癥治療上的一些問題，為癌癥治療提供一種新策略。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

聚乙二醇單甲醚（PEG，Mn= 5 000）：98%（純度，下同），Sigma-Aldrich有限公司；疊氮化鈉（NaN3）：97%，阿拉丁試劑有限公司；氫化鈉（NaH）：99%，阿拉丁試劑有限公司；表氯醇：98%，阿拉丁試劑有限公司；二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）：97%，阿拉丁試劑有限公司；4-二甲基-氨基吡啶（DMAP）：97%，阿拉丁試劑有限公司；五甲基二亞乙基三胺（PMDETA）：98%，泰坦科技有限公司；溴化亞銅（CuBr）：98%，泰坦科技有限公司；甲基丙烯酸二異丙基氨基乙酯（DPA）：98%，泰坦科技有限公司；溴丙炔：98%，泰坦科技有限公司；1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）：98%，泰坦科技有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN）：98%，泰坦科技有限公司；鹽酸阿霉素（DOX·HCl）：97%，北京華豐聯(lián)合技術(shù)公司；Hochest33342（核酸染料）：98%，碧云天生物技術(shù)有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）：98%，碧云天生物技術(shù)有限公司；甲苯，1,4-二氧六環(huán)，濃鹽酸（HCl），甲醇（MeOH），二氯甲烷（DCM），四氫呋喃（THF），N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和三乙胺（TEA）等溶劑購自泰坦科技有限公司（分析純）并且在使用前加入氫化鈣干燥蒸餾收集。參照已發(fā)表文獻(xiàn)的方法合成了鏈轉(zhuǎn)移劑（CTA）4-氰基-4-（十二烷基硫基硫代羰基）硫烷基戊酸（CDSPA）[28]。羥基化四苯基卟啉5-(4-Hydroxylphenyl)-10,15,20-triphenyl-porphyrin (TPP-OH)參照文獻(xiàn)[4]合成。

1.2 測試與表征

氫核磁共振儀（400 MHz，德國Brucker公司，AVANCE Ш 500型）：在室溫下測量，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，氘代氯仿為溶劑。

紫外-可見光光度計（日本SHIMADZU公司，UV-2550型）：室溫下，樣品溶液在石英比色皿中檢測，掃描范圍300～900 nm。

納米粒度儀（美國Beckman Coulter Delsa Nano C型）：測試標(biāo)樣為水相，測試范圍0.6～7 000.0 nm。

共聚焦儀（日本尼康公司，AIR型）：水相60倍放大，激發(fā)光波長420 nm，接收范圍630～675 nm。

1.3 實驗過程

1.3.1 環(huán)氧化物封端的PEG（PEG-epoxy）的合成 將PEG（10.0 g）溶解在80 mL無水甲苯中。共沸蒸餾掉20 mL甲苯后，在氮氣環(huán)境保護(hù)下將NaH（1.0 g，25 mmol）加入到溶液中。在35 ℃油浴鍋中攪拌24 h后，將環(huán)氧氯丙烷（4.0 mL，50 mmol）加入到溶液中，40 ℃下攪拌24 h。之后通過離心除去反應(yīng)中所產(chǎn)生的無機(jī)鹽，并將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將聚合物溶解在少量DCM中并在冰乙醚中沉淀2次，過濾并真空干燥后，收集8.6 g PEG-epoxy。1H-NMR(400 MHz，Chloroform-d，δ) 3.48～3.82 (b，456H)，3.31(s，3H)，3.10 (d，1H), 2.73 (d，1H)，2.54 (d，1H)。

1.3.2 α，α'-疊氮-羥基-PEG（PEG-OH-N3）的合成 PEG-OH-N3通過環(huán)氧化物封端的PEG與NaN3的反應(yīng)合成。將PEG-epoxy（2.0 g，0.38 mmol）溶解在25 mL DMF中，并 將NaN3（0.13 g，2.0 mmol）和NH4Cl（0.11 g，2.0 mmol）混合加入到溶液中。60 ℃下攪拌60 h后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑，然后用DCM稀釋并用飽和食鹽水洗滌3次。將收集到的有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將殘余物在冰乙醚中沉淀3次，過濾并真空干燥后，得 到1.85 g PEG-OH-N3。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d，δ) 3.95 (s，1H)，3.61～3.73 (s，458H)，3.38(s，3H)，3.34 (d，2H)。

1.3.3 酯化反應(yīng)合成PEG-CDSPA-N3將PEG-OHN3（1.0 g，0.2 mmol）溶解在25 mL無水DCM中，將CDSPA（0.22 g，0.6 mmol）和DMAP（24.4 mg，0.2 mol）加入該溶液中，然后，在氮氣環(huán)境下冰浴滴加DCC（51.5 mg，0.25 mmol）的DCM溶液。在25 ℃下攪拌24 h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，然后用DCM稀釋并用飽和食鹽水洗滌3次。將收集到的有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。將殘余物在冰乙醚中沉淀3次，過濾并干燥后，得到0.86 g PEG-CDSPA-N3。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d,δ) 3.96 (s，3H)，3.59～3.71 (s，458H)，3.38 (s，3H)，3.34(d，4H)，2.26 (t，2H)，1.26 (s，20H)，0.88 (t，3H)。

1.3.4 RAFT聚合制備PEG-PDPA-N3將PEG-CDSPA-N3（0.1 g，0.018 mmol）、DPA（0.45 g，2.3 mmol）、AIBN（1.0 mg，0.006 mmol）和1.5 mL 1, 4-二氧六環(huán)加入Schlenk瓶中。經(jīng)過3次凍融循環(huán)除氧后在70 ℃下攪拌18 h，之后將粗產(chǎn)物溶解在甲醇中并用甲醇和水（體積比3∶1）的混合溶液透析以除去未反應(yīng)的單體和副產(chǎn)物，然后用去離子水進(jìn)一步透析以除去甲醇（透析膜截留分子量(MWCO)為8 000）。最后經(jīng)過2 d的凍干后得到0.39 g 聚合度為46的產(chǎn)物PEGPDPA-N3。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d, δ) 3.99(d, 92H)，3.65 (s，458H)，3.38 (s, 3H)，2.95 (d，92H),2.56～2.76 (m，92H), 1.67～1.84 (m，96H)，0.81～1.21 (m，646H)。

1.3.5 以炔基為單官能團(tuán)的卟啉（TPP（Zn2+）-yne）的合成 將單羥基四苯基卟啉鋅配合物（1.0 g，1.63 mmol）溶解于30 mL的無水DCM中，然后加入溴丙炔（387.9 mg，3.31 mmol）和K2CO3（164.6 mg，1.63 mol），之后在氮氣保護(hù)下，40 ℃油浴鍋中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用飽和食鹽水洗滌3次，旋干溶劑。留下的固體過硅膠柱分離，洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚（體積比1∶3）的混合溶液，最后將收集到的目標(biāo)組分旋干并真空干燥，得到0.76 g 的炔基卟啉（TPP（Zn2+）-yne）。1H-NMR (400 MHz, Chloroform-d, δ) 8.87 (d，8H)，8.17 (m，6H)，8.09 (d，2H), 7.64 (m，9H)，7.32 (d，2H)，4.91 (s，2H)，2.62 (s，1H)。

1.3.6 通過點擊化學(xué)反應(yīng)合成PEG-PDPA-TPP 將炔基官能化的四苯基卟啉（10.4 mg，0.016 mmol）和PEG-PDPA-N3（201.2 mg，0.013 mmol）溶于30 mL無水THF中，通氮氣除氧40 min后加入CuBr（3 mg，0.018 mmol）和PMDETA（3.5 mg，0.02 mmol），然后再次通氮氣20 min。在50 ℃油浴鍋中攪拌48 h，結(jié)束后旋干溶劑并溶于MeOH與DCM（體積比1∶3）的混合溶劑中，再加入0.1 mL濃鹽酸，室溫攪拌6 h后旋干溶劑，用飽和食鹽水洗3次后旋干，然后將粗產(chǎn)物溶解在甲醇中并用甲醇和水（體積比3∶1）的混合液透析以除去Cu2+和過量的卟啉，然后用去離子水透析以除去甲醇（MWCO為8 000）。冷凍干燥后，收集到0.16 g 聚合度為46的PEG-PDPA-TPP。1HNMR (400 MHz，Chloroform-d, δ) 8.89 (d，8H)，8.21(m，8H)，7.76 (m，10H)，3.95 (d，93H)，3.65 (s，458H)，3.38 (s，3H)，2.86 (m，92H)，2.23 (t，92H)，1.67 (m，92H)，1.41～1.54 (t，654H)。

TPP修飾的兩親性嵌段共聚物總的合成過程如圖1所示。

1.3.7 制備包載DOX和不含DOX的膠束 通過膜透析方法制備單獨膠束和包載DOX的膠束。對于單獨膠束，將10 mg共聚物溶解在2 mLTHF與DMF（體積比1∶4）的混合溶劑中。磁力攪拌下在30 min內(nèi)將混合物滴加到3 mL去離子水中。然后用去離子水透析24 h以除去有機(jī)溶劑。裝載DOX的膠束的制備方法與單獨膠束的制備方法相似，如圖2所示。將DOX·HCl（1.33 mg，用3倍的TEA處理）和共聚物（10 mg）溶解在2 mL THF與DMF（體積比2∶3）混合溶劑中。在磁力攪拌下將混合物滴加到3 mL去離子水中30 min，用去離子水透析24 h以除去溶劑和游離DOX。冷凍干燥后，將裝載DOX的膠束溶解在DMF中，并根據(jù)校準(zhǔn)曲線通過紫外-可見光光度計在500 nm處測定DOX的量。藥物負(fù)載量（DLC）定義為包載在膠束中的藥物質(zhì)量與包載藥物后膠束的總質(zhì)量之比，藥物包載率（EE）定義為包載在膠束中的藥物質(zhì)量與包載藥物質(zhì)量之比。

1.3.8 臨界膠束濃度（CMC）的測定 使用芘作為熒光探針來測定CMC。將芘溶解在丙酮中制備一定濃度的溶液，然后向每個容量瓶中加入一定量的芘溶液和不同濃度的聚合物樣品溶液，此時各容量瓶中配制的芘的濃度均為6×10-7mol/L。以335 nm的光激發(fā)，接收的熒光波長范圍調(diào)整為335～450 nm。激發(fā)發(fā)射狹縫設(shè)定為20 nm和10 nm。以383 nm處的熒光吸收強(qiáng)度（I383）和372 nm處的熒光吸收強(qiáng)度（I372）的比值計算膠束的CMC。

圖 1 TPP修飾的兩親性嵌段共聚物的合成步驟Fig. 1 Synthesis procedure of TPP modified amphiphilic block copolymer

圖 2 包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束的制備及膠束包吞入細(xì)胞內(nèi)的過程示意圖Fig. 2 Schematic diagram showing the preparation of DOXloaded PEG-PDPA-TPP micelles and their encapsulation by cells

1.3.9 體外DOX的釋放實驗 使用透析膜（截留分子量3 500）研究DOX的釋放行為。將DOX裝入到透析膜中并浸入到30 mL PBS溶液中，溫度保持在37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min。每隔一段時間取出1.5 mL透析溶液并加入到等體積的新鮮PBS溶液中。測試500 nm處的紫外吸收強(qiáng)度，再與DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算DOX的釋放速率。

1.3.10 細(xì)胞培養(yǎng)實驗 將Hela細(xì)胞（Henrietta Lacks細(xì)胞）在含有w=10%胎牛血清（FBS）和w=1%抗生素（50 U/ mL青霉素和50 U/ mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞皿放在專門的恒溫箱中培養(yǎng)（37 ℃，φ=5% CO2）。

1.3.11 細(xì)胞毒性實驗 將含有Hela細(xì)胞的懸浮液加入到96孔板中孵育，密度為每孔5×103個細(xì)胞。對于細(xì)胞暗毒實驗，在孔板中加入各種濃度的自由DOX、自由TPP、PEG-PDPA-TPP膠束和裝載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束處理細(xì)胞。將細(xì)胞放在黑暗中培養(yǎng)24 h，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT（5 mg/mL）測定法進(jìn)行死活測試，使用SpectraMax光譜儀測定560 nm處的吸光度。細(xì)胞存活率計算如下：

其中：ODtest是加入藥品后的吸光度；ODcontrol是空白對照樣的吸光度；ODblank是空板的吸光度。

用不同濃度的PEG-PDPA-TPP、包載DOX的PEG-PDPA-TPP、包載TPP的PEG-PDPA膠束溶液處理Hela細(xì)胞并孵育24 h，然后用655 nm（0.3 W/cm2）的激光照射孔板10 min。而后再培養(yǎng)24 h，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT（5 mg/mL）測定法評估細(xì)胞死活率。

1.3.12 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）成像實驗

將約5×103個Hela細(xì)胞接種到每個玻璃底的器皿中，并加入含有w=10%FBS的DMEM中培育24 h。然后，用TPP質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的游離TPP和包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束分別處理細(xì)胞，分別培育4 h和24 h后，除去培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌3次，之后將細(xì)胞用多聚甲醛（w=4%）的PBS溶液固定25 min，然后用Hoechst 33342染色以標(biāo)記細(xì)胞核。最后，使用熒光顯微鏡（Nikon AIR）進(jìn)行細(xì)胞的CLSM成像拍攝。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG-PDPA-TPP嵌段共聚物的合成及其表征

通過RAFT聚合和點擊化學(xué)反應(yīng)的結(jié)合，合成了含TPP的嵌段共聚物。TPP位于親水性的PEG嵌段和疏水性的PDPA嵌段之間的連接點處（圖1）。而后通過自組裝形成包載化療藥物DOX的納米膠束，細(xì)胞實驗驗證其治療效果。

PEG-PDPA-TPP嵌段共聚物的合成包括以下步驟：

（1）通過將表氯醇接枝到具有單羥基端基的PEG上來合成PEG-環(huán)氧樹脂。

（2）環(huán)氧化物官能化的PRG進(jìn)一步與疊氮化鈉反應(yīng)，打開環(huán)氧環(huán)，得到疊氮化物官能化的PEG（PEGOH-N3）。值得注意的是，開環(huán)反應(yīng)同時會產(chǎn)生一個末端羥基。

（3）在室溫下通過DCC/DMAP的酯化體系將用于RAFT聚合的鏈轉(zhuǎn)移劑CDSPA成功引入到PEG鏈上。將連接了CDSPA的疊氮化物官能化的PEG命名為PEG-CDSPA-N3。

（4）用PEG-CDSPA-N3作為大分子的RAFT劑，通過DPA的RAFT聚合合成嵌段共聚物PEGPDPA-N3。圖3（a）示出了PEG-PDPA-N3的1H-NMR譜和各個峰的分配?；?H-NMR的數(shù)據(jù)可以計算PDPA的聚合度（DP）為46，同時在其13C-NMR譜（圖3（d））中，可以清楚地看到PEG與PDPA鏈段上的各個碳的歸屬情況，亦證明了PEG-PDPA-N3被成功合成。

（5）將參照之前文獻(xiàn)合成的羥基卟啉與丙炔酸進(jìn)行酯化反應(yīng)，合成端基為炔基的卟啉。其氫核磁譜圖如圖3（b）所示，可以證明其被成功合成。

（6）通過Cu（I）催化疊氮化物與炔烴環(huán)的加成反應(yīng)（點擊化學(xué)反應(yīng)）將TPP接到連接點上。圖3（c）示出了連接了TPP的嵌段共聚物的1H-NMR譜，其被命名為PEG-PDPA-TPP。同時，將PEG-PDPA-TPP的13C-NMR譜圖與PEG-PDPA-N3進(jìn)行對比，可以清楚地看到TPP苯環(huán)上的C特征峰出現(xiàn)在了譜圖上（圖3（e）中的j和k），亦證明了TPP成功地接在了聚合物上。

體積排除色譜（SEC）用于表征合成聚合物的分子量和多分散性指數(shù)（PDI）的變化。官能化的PEG鏈和嵌段共聚物的SEC曲線如圖4所示。PEGCDSPA-N3相對于前一步化合物僅導(dǎo)致SEC曲線產(chǎn)生了輕微偏移。而DPA的RAFT聚合導(dǎo)致SEC線中的洗脫時間的明顯減少。連接TPP后，聚合物分子量增大，SEC出峰向左產(chǎn)生了輕微偏移。同時，所有含TPP的嵌段共聚物的分子量分布非常窄。關(guān)于聚合物的分子量和分子量分布的詳細(xì)信息如表1所示。

2.2 PEG-PDPA-TPP等樣品在水溶液中的自組裝

PEG-PDPA-TPP嵌段共聚物組裝后在去離子水中透析后可形成膠束。采用芘用作熒光探針，基于在383 nm和372 nm處的芘單體發(fā)射的電子振動帶的強(qiáng)度比來測量PEG-PDPA-TPP嵌段共聚物的CMC。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，I383/I372的值在低質(zhì)量濃度時僅略有增加，但在一定質(zhì)量濃度后呈現(xiàn)顯著增加，表明芘分子從水溶液轉(zhuǎn)移到形成的膠束的疏水核心區(qū)域。CMC被確定為低質(zhì)量濃度區(qū)域和高質(zhì)量濃度區(qū)域的I383/I372的比率外推的交叉點（圖5（a））。同時基于自組裝和pH響應(yīng)行為，PEGPDPA-TPP被用作藥物釋放的獨特載體。選擇DOX作為模型化療藥物，并通過納米沉淀法制備負(fù)載DOX的聚合物膠束。將包載DOX的聚合物膠束在去離子水中透析24 h。凍干后溶解于DMF中，根據(jù)500 nm處的吸光度計算DOX含量。當(dāng)DOX與共聚物的質(zhì)量比為1∶5時，包載有DOX的PEGPDPA-TPP膠束的載藥量和包封率分別為3.1%±0.5%和18.6%±3.3%。動態(tài)光散射儀（DLS）用于分析PEG-PDPA-TPP、包載DOX的PEG-PDPA-TPP和包載TPP的PEG-PDPA的自組裝的尺寸（圖5（b））。值得注意的是，所有膠束都具有較窄的尺寸分布。

2.3 包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束的pH響應(yīng)實驗

據(jù)報道腫瘤細(xì)胞溶酶體中的pH為5.0～5.5。pH響應(yīng)性的載體需要高度滿足在弱酸性的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境下藥物釋放的要求。PDPA在重復(fù)單元中具有叔胺基團(tuán)，這使其成為pH響應(yīng)聚合物的理想候選材料。PDPA鏈在中性或堿性環(huán)境下疏水段塌陷，而由于叔胺基團(tuán)在酸性條件下質(zhì)子化轉(zhuǎn)變?yōu)閹щ娢镔|(zhì)，從而會在酸性環(huán)境下伸展。采用DLS技術(shù)研究包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束在不同pH緩沖溶液中自組裝的流體動力學(xué)尺寸變化。如圖5（b）所示，當(dāng)pH從7.4降至6.5時，膠束的流體動力學(xué)直徑從約98 nm增長至378 nm。當(dāng)緩沖溶液的pH進(jìn)一步降低至5.5時，組裝體的流體動力學(xué)尺寸上升至1 081 nm，與此同時PDI呈現(xiàn)上漲，膠束粒徑表現(xiàn)出強(qiáng)烈的不穩(wěn)定性，說明膠束解離并且包載DOX釋放值之后聚集。這些結(jié)果說明了PEG-PDPA-TPP膠束在pH梯度下的pH響應(yīng)行為。

圖 3 （a）PEG-PDPA-N3，（b）TPP(Zn2+)-yne，（c）PEG-PDPA-TPP的1H-NMR譜圖；（d）PEG-PDPA-N3，（e）PEG-PDPA-TPP的13CNMR 譜圖Fig. 3 1H-NMR spectra of (a) PEG-PDPA-N3, (b) TPP(Zn2+)-yne, (c)PEG-PDPA-TPP, 13C-NMR spectra of (d) PEG-PDPA-N3 and (e) PEGPDPA-TPP

與此同時，用酸性緩沖溶液模擬細(xì)胞內(nèi)的酸環(huán)境，測試包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束在不同pH時的釋放行為（ 圖6）。在pH=7.4的緩沖溶液中，在50 h內(nèi)從膠束中發(fā)現(xiàn)DOX的低釋放（21%），這表明膠束在血液循環(huán)期間相對穩(wěn)定。然而，當(dāng)緩沖溶液的pH降至5.5時，由于膠束的解離，有72%的DOX釋放。這表明聚合物膠束是DOX釋放的良好載體，而它在血液循環(huán)期間是穩(wěn)定的，但在細(xì)胞攝取后能夠有效釋放DOX。

圖 4 PEG-epoxy、 PEG-CDSPA-N3、 PEG-PDPA-N3,和PEG-PDPA-TPP的體積排除色譜曲線Fig. 4 SEC traces of PEG-epoxy, PEG-CDSPA-N3, PEG-PDPAN3 and PEG-PDPA-TPP

表 1 聚合物的分子量和多分散性Table 1 Molecular weight and polydispersity of the polymers

2.4 聚合物單線態(tài)氧產(chǎn)生實驗

卟啉作為一種典型的光敏劑，在癌癥治療方面有很好的研究，然而由于卟啉的官能化困難，難以連接到聚合物上，因此通常只是包裹在納米載體中，而TPP的聚集則會引起其單線態(tài)氧產(chǎn)率的降低。將DBPF用作猝滅劑以評估PEG-PDPA-TPP膠束的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率。通過UV-vis吸收監(jiān)測單線態(tài)氧猝滅的DPBF的量。測定了TPP（含w=0.1%DMSO的水溶液）和PEG-PDPA-TPP膠束在不同655 nm激光照射時間下的UV-vis光譜變化。為了獲得更直觀的結(jié)果，收集樣品在410 nm處的吸收強(qiáng)度值（I410）并繪制在圖7中。TPP樣品顯示出較低的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率的原因主要是因為TPP的聚集。相反，在PEGPDPA-TPP膠束中，由于TPP組裝在球形膠束的表面，減少了TPP的聚集并且擁有確定的形態(tài)，從而具有更高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率。因此，在同等TPP濃度下，PEG-PDPA-TPP膠束使得TPP的聚集猝滅效應(yīng)減少，其單線態(tài)氧產(chǎn)率會明顯高于自由的TPP，表現(xiàn)在測試結(jié)果中則是PEG-PDPA-TPP 膠束中的DPBF的吸收峰的衰減速度會明顯快于TPP，這與實驗結(jié)果相符合。

圖 5 （a）PEG-PDPA-TPP和PEG-PDPA的臨界膠束濃度；（b）動態(tài)光散射儀測試的PEG-PDPA + TPP，PEG-PDPA-TPP，PEGPDPA-TPP + DOX（PBS，pH=7.4），PEG-PDPA-TPP + DOX（pH=6.5）和PEG-PDPA-TPP + DOX（pH=5.5）粒徑分布圖Fig. 5 (a) CMC of PEG-PDPA-TPP and PEG-PDPA (b) Hydrodynamic diameters of PEG-PDPA + TPP, PEG-PDPA-TPP, PEG-PDPA-TPP +DOX (PBS, pH=7.4), PEG-PDPA-TPP + DOX (pH=6.5); and PEG-PDPA-TPP + DOX (pH=5.5) micelles in aqueous solution determined by DLS

2.5 細(xì)胞毒性實驗

通過MTT測定法研究了PEG-PDPA-TPP膠束、包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束、游離DOX和游離TPP細(xì)胞的暗毒，結(jié)果如圖8（a）所示。由于PEG鏈段和TPP具有良好的生物相容性，因此嵌段共聚物PEG-PDPA-TPP和游離TPP幾乎不顯示細(xì)胞暗毒。另一方面，通過增加樣品濃度，游離DOX的細(xì)胞增殖抑制顯著增加。值得注意的是，包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束顯示出比PEG-PDPA-TPP更高的細(xì)胞暗毒，但是比游離DOX的細(xì)胞暗毒低得多。這主要是由于pH響應(yīng)性PDPA鏈在細(xì)胞攝取后在酸性微環(huán)境中會有DOX的緩釋作用，相比于游離DOX要溫和許多。表明包載DOX的PEG-PDPATPP膠束是良好的藥物釋放平臺。

為了分析PEG-PDPA-TPP膠束和包載TPP的PEG-PDPA膠束之間的差異，進(jìn)一步研究了具有相同TPP含量的兩種樣品的光毒性（圖8（b））。由暗毒實驗可知兩種樣品幾乎都沒有暗毒性。使用激光束（655 nm，300 mW/cm2）照射孔板10 min從而進(jìn)一步研究樣品的光毒性。PEG-PDPA-TPP膠束在光毒性方面顯示出比包載TPP的PEG-PDPA膠束更高的細(xì)胞增殖抑制作用，即更大的細(xì)胞毒性。這表明在中間節(jié)點處連接有TPP的嵌段共聚物表現(xiàn)出比物理包封更顯著的癌癥治療功效，這與單線態(tài)氧量子產(chǎn)率的結(jié)果高度一致。同時包載DOX的PEG-PDPATPP膠束在655 nm激光照射（10 min）后相比于PEGPDPA-TPP（光毒）和PEG-PDPA-TPP+DOX膠束（暗毒）展現(xiàn)出更好的細(xì)胞抑制作用，表明化療與光動力治療相結(jié)合之后，包載DOX的PEG-PDPA-TPP膠束具有更佳的癌細(xì)胞抑制效果。

圖 6 包載有DOX的PEG-PDPA-TPP膠束在不同pH的磷酸鹽緩沖液中的體外釋放行為（37 °C）Fig. 6 In vitro release behavior of DOX-loaded PEG-PDPA-TPP micelles in PBS buffer solutions with different pH ( 37°C)

圖 7 PEG-PDPA-TPP膠束和純TPP（w=0.1%的DMSO）加入DPBF后，隨著激光照射（655 nm，0.3 W/cm2，ρTPP=3.0 μg/mL）不同時間后，在410 nm處的吸光強(qiáng)度相對衰減圖Fig. 7 Plots of I420 against irradiation time, PEG-PDPA-TPP micelles with DPBF probe and free TPP (w =0.1% DMSO)micelles with DPBF probe (655 nm, 0.3 W/cm2, ρTPP=3.0 μg/mL)

圖 8 用MTT法測試的細(xì)胞存活率：（a）PEG-PDPA-TPP、包載的 PEG-PDPA-TPP+DOX膠束、游離DOX和游離TPP的暗毒；（b）PEG-PDPA-TPP 膠束、 PEG-PDPA+TPP膠束的光毒和暗毒、PEG-PDPA-TPP + DOX膠束的暗毒和光毒（655 nm，300 mW/cm2，10 min）Fig. 8 Cell viability determined by MTT assay: (a) Dark toxicity of PEG-PDPA-TPP micelles, PEG-PDPA-TPP+DOX micelles, free DOX and free TPP; (b) Photo toxicity and dark toxicity of PEG-PDPA-TPP micelles, PEG-PDPA+TPP micelles，dark and photo toxicity of PEGPDPA-TPP + DOX micelles (655 nm, 300 mW/cm2, 10 min)

2.6 細(xì)胞攝取成像實驗（激光共聚焦成像）

為了確定PEG-PDPA-TPP + DOX膠束的細(xì)胞攝取情況，且由于TPP自帶熒光成像的作用，采用CLSM以評估細(xì)胞內(nèi)膠束的攝取和分布情況。用具有相同TPP濃度的游離TPP和PEG-PDPA-TPP +DOX膠束（ρTPP= 1.0 μg/mL）分別處理Hela細(xì)胞4 h和24 h，然后加入Hoechst33342用于細(xì)胞核的染色（藍(lán)色熒光）。如圖9所示，幾乎所有的卟啉熒光都是在細(xì)胞質(zhì)或非核的細(xì)胞器中，這可能是因為卟啉和PEG-PDPA-TPP + DOX膠束都不具有細(xì)胞核靶向，無法穿越細(xì)胞核膜中的核孔復(fù)合物（NPS），這也與文獻(xiàn)中的報道相符合[16,29]。隨著時間的增加，無論是游離的TPP或者PEG-PDPA-TPP + DOX膠束，24 h時的TPP熒光強(qiáng)度都要明顯強(qiáng)于4 h的TPP熒光強(qiáng)度。這表明樣品的攝取是時間決定性的，隨著時間的延長，細(xì)胞會攝取更多的樣品，這與我們選擇加藥培育24 h再進(jìn)行光照治療的選擇相符合。并且在4 h和24 h時，PEG-PDPA-TPP + DOX膠束（圖9（b），9（d））與游離TPP處理的細(xì)胞（圖9（a），9（c））對比度更強(qiáng)，經(jīng)PEG-PDPA-TPP + DOX膠束處理的細(xì)胞所顯示的TPP的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于游離TPP所處理的細(xì)胞，表明相對于游離的TPP，細(xì)胞會攝取更多的PEG-PDPA-TPP + DOX膠束。這是由于游離的TPP是通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而PEG-PDPA-TPP +DOX納米粒子是通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，更容易被細(xì)胞攝取。

圖 9 加入不同樣品后的激光共聚焦成像照片（ρTPP = 1.0 μg/mL）Fig. 9 CLSM images of Hela cells incubated with different samples (ρTPP = 1.0 μg/mL)

3 結(jié) 論

（1）成功構(gòu)建了在中間連接點具有TPP單元的pH響應(yīng)性的兩親性嵌段共聚物，其在水溶液中的自組裝可以得到TPP規(guī)則排列在核周圍的球形膠束。

（2）相比于物理包裹TPP，中間連接點具有TPP單元的兩親性嵌段共聚物不僅具有確定的分子結(jié)構(gòu)并能夠減少卟啉的聚集，顯著增強(qiáng)TPP的光動力效果，同時也可作為載藥平臺用于藥物的遞送。

（3）PEG-PDPA-TPP 包載 DOX膠束的pH響應(yīng)釋放行為可以通過腫瘤細(xì)胞攝取期間的弱酸性細(xì)胞微環(huán)境來調(diào)控。同時CLSM顯示，相比于游離的TPP，將TPP連接在兩親性嵌段共聚物的組裝體可以更好地被細(xì)胞所攝取。這種膠束遞送系統(tǒng)是一種具有廣泛應(yīng)用前景的環(huán)境響應(yīng)性和光動力與化療協(xié)同治療的納米平臺。