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    梅州地區(qū)柑橘黃龍病的常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用

    2020-05-06 13:29:28李月張志標(biāo)周玉蓉鐘進(jìn)良馬瑞豐劉蕊黃城陶星星
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 2020年8期
    關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度

    李月 張志標(biāo) 周玉蓉 鐘進(jìn)良 馬瑞豐 劉蕊 黃城 陶星星

    摘要? ? 本文利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)技術(shù)對(duì)梅州地區(qū)疑似柑橘黃龍病樣品進(jìn)行檢測(cè),并與常規(guī)PCR檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明,實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)柑橘黃龍病菌結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠且無污染。采用2種方法對(duì)梯度稀釋的陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度較常規(guī)PCR更高,能夠檢出樣品中痕量的病原菌。本研究在梅州地區(qū)建立了以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行柑橘黃龍病疑似植株的檢測(cè),可以為梅州地區(qū)提供更準(zhǔn)確、更靈敏、快速的黃龍病檢測(cè)技術(shù)。

    關(guān)鍵詞? ? 柑橘黃龍病;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;靈敏度;廣東梅州

    中圖分類號(hào)? ? S664.4? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

    文章編號(hào)? ?1007-5739(2020)08-0103-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID)

    Abstract? ? In this paper,TaqMan probe real-time quantitative PCR(qPCR)detection technology was used to detect suspected citrus huanglongb-ing samples in Meizhou area,and compared with conventional PCR detection.The results showed that real-time fluorescent quantitative PCR for detecting citrus huanglongbing was fast,accurate,reliable and free pollution.Two methods were used to detect the gradient-diluted positive samples,which showed that the sensitivity of real-time quantitative PCR was higher than that of conventional PCR,and it could detect trace amounts of pathogenic bacteria in the samples.This study established a real-time quantitative PCR method to detect suspected citrus Huanglongbing plants in Meizhou area,which could provide more accurate,sensitive and rapid Huanglongbing detection technology in Meizhou area.

    Key words? ? citrus huanglongbing;real-time fluorescent quantitative PCR;sensitivity;Meizhou Guangdong

    柑橘作為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),產(chǎn)量居于世界水果之首[1]。梅州市作為全國最大的柚類生產(chǎn)基地,生產(chǎn)區(qū)域覆蓋了所轄的梅江區(qū)、梅縣區(qū)、大埔縣、興寧市、五華縣等共65個(gè)鎮(zhèn)[2]。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大,其病蟲害問題也接踵而至,其中最為嚴(yán)重的是柑橘黃龍?。╟irtus huanglongbing,HLB)。柑橘黃龍病病原菌隸屬于韌皮部桿菌屬(Candidatus Liberobacter),分為亞洲種(Can-didatus Liberibacter asiaticus)、非洲種(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲種(Candidatus Liberibacter americanus)[3-4],其傳播方式主要為柑橘木虱傳播、嫁接傳播和運(yùn)輸傳播3種方式。

    柑橘黃龍病在田間的癥狀表現(xiàn)復(fù)雜難辨,其典型癥狀為葉片斑駁黃化、紅鼻子果、新梢均勻黃化等。目前,國內(nèi)外對(duì)柑橘黃龍病的檢測(cè)方法除了田間癥狀診斷外,還有嫁接診斷、生化和電鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)等[5]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法因其準(zhǔn)確度和靈敏度高、操作簡便、檢測(cè)快速等被廣泛用于柑橘黃龍病的診斷。常用的PCR檢測(cè)方法包括常規(guī)PCR、巢式PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等3種方法。

    本文利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)梅州地區(qū)疑似柑橘黃龍病樣品進(jìn)行檢測(cè)。TaqMan探針使用雜交探針,特異性高且可靠,由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增片段小、靈敏度好、穩(wěn)定性高、不易受外界污染、操作簡便等優(yōu)勢(shì),使實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī)PCR更適用于檢測(cè)柑橘黃龍病疑似樣本。

    1? ? 材料與方法

    1.1? ? 試驗(yàn)材料

    植物樣品主要來自梅州各個(gè)縣區(qū)的柑橘種植園,植株葉片出現(xiàn)原因不明的黃化現(xiàn)象。陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株。

    1.2? ? 試驗(yàn)方法

    1.2.1? ? 植物總基因組DNA的提取。柑橘植株總基因組的提取方法參照天根生物公司高效植物基因組DNA提取試劑盒,并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行簡單修改。稱取0.1 g新鮮柑橘葉脈,用剪刀剪碎后放入2 mL離心管中,加入400 μL緩沖液FGA和6 μL RNaseA(10 mg/μL),置于組織研磨機(jī)(MP Fast-Prep-24)中高速振蕩研磨25 s,后續(xù)提取程序參照基因組提取試劑盒說明書[6]。

    取2 μL 提取的基因組DNA 在超微量分光光度計(jì)(Na-noDrop One)上檢測(cè)樣品濃度及純度,剩余樣品置于-20 ℃冰箱貯藏備用。

    1.2.2? ? 引物。利用柑橘黃龍病病原亞洲種的16S rDNA設(shè)計(jì)合成引物,由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,具體見表1、2。

    1.2.3? ? 常規(guī)PCR。常規(guī)PCR的擴(kuò)增體系為25 μL,其中DNA模板1.0 μL,引物 OI1和OI2c各1.0 μL,2xPCRmaster Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,退火溫度60 ℃,72 ℃ 60 s,共35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min??瞻讓?duì)照為ddH2O,陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地健康植株提取的基因組DNA,陽性對(duì)照為帶病植株基因組DNA。PCR擴(kuò)增完成后,取6.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,以5.0 μL DNA Marker(DL 2000,TAKARA)為標(biāo)記進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,電壓100 V,時(shí)間35 min。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果,如在1 167 bp(OI1/OI2c為引物)處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,則該樣品為陽性,該植株感染黃龍病。

    1.2.4? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為20 μL,其中DNA模板2.5 μL,引物HLB asf和HLB asr各0.5 μL,HLB Probe 0.25 μL,Master Mix 10 μL,ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)程序在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(StepOnePlus)上進(jìn)行,在95 ℃條件下預(yù)變性30 s,95 ℃ 10 s,60℃ 10 s,60 ℃ 20 s同步多次采集熒光,共40個(gè)循環(huán)??瞻讓?duì)照為ddH2O,陰性對(duì)照為梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株提取的基因組DNA,陽性對(duì)照為帶病植株基因組DNA。檢測(cè)結(jié)果以反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即 CT值)顯示,CT值≤35表示該樣品為黃龍病陽性,CT值>35為陰性,CT值越低,則表明黃龍病菌含量越高。

    1.2.5? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度對(duì)比。取同時(shí)通過1.2.3和1.2.4方法檢測(cè)確定為陽性的樣品,通過超微量分光光度計(jì)對(duì)其基因組DNA濃度進(jìn)行檢測(cè),確定樣品基因組DNA的濃度,并進(jìn)行梯度稀釋,分別用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)稀釋后的系列樣品進(jìn)行檢測(cè)。

    2? ? 結(jié)果與分析

    2.1? ? 柑橘總DNA的提取及含量檢測(cè)

    以疑似感染黃龍病植株葉片的葉脈為材料提取基因組DNA,基因組DNA的A260/A280比值在1.6~1.9之間,提取效果較好,可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

    2.2? ? 柑橘黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

    為了評(píng)價(jià)常規(guī)PCR方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果的符合程度,用以上2種方法分別對(duì)梅州市各縣區(qū)采集的疑似黃龍病樣品共40個(gè)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見圖1、2及表3。

    給常規(guī)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),9個(gè)樣品在1 167 bp處擴(kuò)增出特異性電泳條帶,陰性對(duì)照、空白對(duì)照在此位置無特異性擴(kuò)增條帶;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),12個(gè)樣品的CT值≤35,即為黃龍病陽性,陰性對(duì)照、空白對(duì)照無CT值。對(duì)比檢測(cè)結(jié)果,只要實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)為陽性的樣品,常規(guī)PCR全為陽性,表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)柑橘黃龍病菌結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠且無污染,同時(shí)避免了使用有害物質(zhì)。

    2.3? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度對(duì)比

    取同時(shí)通過常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)確定為陽性的樣品,通過超微量分光光度計(jì)確定樣品基因組 DNA濃度,并進(jìn)行梯度稀釋,結(jié)果見表4。分別用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)稀釋后的系列樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示??梢钥闯?,在相同稀釋倍數(shù)下,常規(guī)PCR檢測(cè)為陰性的樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性,表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度較常規(guī)PCR更高,能夠檢出樣品中痕量的病原菌。

    3? ? 結(jié)論與討論

    本實(shí)驗(yàn)室在梅州地區(qū)建立了柑橘黃龍病PCR快速檢測(cè)技術(shù)[6],在檢測(cè)篩查過程中發(fā)現(xiàn),同樣的植株,半年前檢測(cè)結(jié)果為陰性,在半年后的檢測(cè)中呈陽性,顯示常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)黃龍病感染初期的檢出率較低。因此,本研究建立了以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行柑橘黃龍病疑似植株的檢測(cè),可以為梅州地區(qū)提供更準(zhǔn)確、更靈敏、更快速的柑橘黃龍病檢測(cè)技術(shù)。

    由于柑橘品種種類繁多,在田間情況下感染黃龍病的表現(xiàn)形式不一而同,不同病害、藥害、缺素等表現(xiàn)癥狀也給田間診斷黃龍病增加了難度,且黃龍病菌在植株體內(nèi)含量分布不均勻,因而常導(dǎo)致誤診。而PCR技術(shù)的快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)使其成為當(dāng)前檢測(cè)柑橘黃龍病的主要手段。常規(guī)PCR成本較低,多適用于大規(guī)模的田間初次普查檢測(cè);實(shí)時(shí)熒光定量PCR適合對(duì)常規(guī)PCR沒有檢出的疑似樣品進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)確認(rèn),或?qū)S龍病菌侵染早期、含菌量較低的樣本,如種苗、接穗等進(jìn)行檢測(cè)。

    在實(shí)際應(yīng)用中,可結(jié)合田間診斷,通過“紅鼻子果”以及葉片斑駁黃化這2個(gè)特征對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[8],并通過常規(guī)PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

    4? ? 參考文獻(xiàn)

    [1] 鄧秀新.世界柑橘品種改良的進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(6):1140-1146.

    [2] 李月,張志標(biāo),鐘進(jìn)良,等.梅州柚產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2019(3):75-78.

    [3] TEXEIRA D C,AYRES J,KITAJIMA E W,et al.First report of a huangl-ongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State,Braziland association of a new liberibacter species,"Candidatus Liberibacter americanus",with the disease[J].Plant Disease,2005,6:89-107.

    [4] 胡文召,周常勇.柑橘黃龍病病原研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2010,36(3):30-33.

    [5] 胡浩.應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)研究亞洲韌皮部桿菌在寄主體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及分布[D].重慶:重慶大學(xué),2007.

    [6] 張志標(biāo),李月,黃城,等.梅州地區(qū)柑橘黃龍病的PCR快速檢測(cè)[J].東南園藝,2018(5):19-22.

    [7] WENBIN LI,JOHN S,HARTUNG,LAURENE LEVY.Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associate with citrus huanglongbing[J].Journal of Microbiological Methods,2006(66):104-115.

    [8] 吳礽超,趙小龍,王明召.柑橘黃龍病檢測(cè)技術(shù)概述[J].廣西園藝,2007,18(6):59-60.

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