實時熒光定量PCR技術(shù)在番茄研究中的應(yīng)用

郝志愚　金鳳媚　薛俊　宋建

摘 要：隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，該技術(shù)越來越受到人們的青睞。它以快速、靈敏、高特異性和安全性高等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究等各個領(lǐng)域。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)在番茄的各研究領(lǐng)域不斷深入，大大提高了番茄的病害檢測能力、特異基因的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)基因的檢測效率。

關(guān)鍵詞： 實時熒光定量PCR；番茄；檢測

中圖分類號： S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.010

自PCR技術(shù)問世以來，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，并不斷衍生出許多新的技術(shù)使其應(yīng)用泛圍不斷擴(kuò)大，特異性和敏感性也不斷提高。實時定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction， Real-time PCR）技術(shù)就是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上提出的 [1]，該技術(shù)于1996 年在美國Applied Biosystems 公司研究成功。目前，已廣泛應(yīng)用于植物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、海關(guān)檢疫等領(lǐng)域[1-3]。近幾年，實時熒光定量PCR 技術(shù)也有力地提高了番茄各研究領(lǐng)域的水平，而且發(fā)揮著越來越重要的作用，筆者將重點在這方面進(jìn)行綜合論述。

1 Realtime PCR技術(shù)原理

所謂的實時熒光定量 PCR 就是通過對 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。在PCR 指數(shù)擴(kuò)增期間，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量[4-5]。實時熒光定量 PCR 的化學(xué)原理可分為兩大類：探針類和非探針類，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，如TaqMan 探針、分子信標(biāo)等，建立在熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理（FRET）上[6]；非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加，常用的有SYBR Green 和LC Green。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

由于實時熒光定量PCR技術(shù)能在PCR 整個擴(kuò)增反應(yīng)過程監(jiān)的每一步循環(huán)中檢測擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增情況 ，也可以精確定量起始樣品的量，因此被認(rèn)為是一項具有革命性的技術(shù)。

2 實時熒光定量PCR的特點

2.1 速度快，簡單便捷

實時熒光定量PCR是在一個封閉的反應(yīng)體系中進(jìn)行，不需要電泳、染色的步驟，其操作步驟大大減少。而且實時熒光定量PCR 儀采用了新的升降溫機制，從而大大縮短了擴(kuò)增反應(yīng)的時間，一般整個過程只需2 h。與常規(guī)PCR 相比，實時熒光定量PCR 的一個主要優(yōu)勢是可以快速提供可靠的數(shù)據(jù)[7]。

2.2 靈敏性高

實時定量PCR技術(shù)結(jié)合了光譜技術(shù)和計算機技術(shù)，其檢測的靈敏度得到了很大的提升，檢測的最低DNA濃度可達(dá)pg級水平[8]。當(dāng)樣品中的DNA 量很低時， 用紫外光度法和凝膠斑點定量法測定幾乎不能檢測到時，采用實時熒光PCR 技術(shù)，除了可以提供PCR 擴(kuò)增的信息外，還可以了解DNA濃度。對番茄潰瘍病檢測的結(jié)果表明，實時熒光定量PCR比普通的PCR檢測結(jié)果靈敏度高100倍左右[9]。

2.3 高度的特異性

由于在PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光探針， 該探針是針對靶序列設(shè)計，使得非特異性產(chǎn)物不能與探針雜交，尤其對與特異性產(chǎn)物分子量接近、通過電泳無法分開的產(chǎn)物更為有效，相當(dāng)于在PCR的過程中自動完成了Southern雜交，具有高特異性。

2.4 安全性高

實時熒光定量PCR是在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的， 不需要用溴化乙錠（EB）染色，降低了對環(huán)境和操作人員的污染。

3 PCR技術(shù)在番茄研究中的應(yīng)用

目前，實時熒光定量PCR 已作為一個實用的方法被應(yīng)用于番茄病害檢測、轉(zhuǎn)基因的檢測和基因表達(dá)的研究等方面。

3.1 在番茄病害檢測中的應(yīng)用

1999年Bohm 等[10]首次將實時定量PCR方法應(yīng)用于植物病理學(xué)研究。自此之后，這種技術(shù)在小麥、水稻、馬鈴薯等作物的病害上得到了廣泛的應(yīng)用。在番茄的病毒病檢測中也起到了重要的作用。朱建裕等[11]根據(jù)番茄環(huán)斑病毒（ ToRSV） 各株系RNA1聚合酶基因的保守序列，建立了對ToRSV 的實時熒光RT-PCR 檢測方法。該方法利用TaqMan熒光探針實時監(jiān)測目的基因的擴(kuò)增， 實現(xiàn)RT-PCR 擴(kuò)增與探針檢測同時進(jìn)行，不需PCR 后處理， 消除了PCR 產(chǎn)物的污染，不需電泳和EB 染色，減少了檢測步驟， 節(jié)省了時間。林銘等[12]和阮美穎等[13]針對目前番茄生產(chǎn)中為害嚴(yán)重的TYLCV病毒分別用SYBR Green I 檢測模式和TaqMan探針進(jìn)行了實時熒光定量PCR 檢測的研究，通過比較普通PCR 與熒光定量PCR 的靈敏度，發(fā)現(xiàn)后者的靈敏度比前者高100倍，采用熒光定量PCR 方法可以檢測到微量病毒。這就為及早發(fā)現(xiàn)病毒、提早防治提供了技術(shù)保證。另外，該方法還被應(yīng)用在番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus ，TSWV）和番茄不孕病毒 （ tomato aspermy virus， TAV ）的檢測中，整個檢測過程僅需2 h， 被證明是一種操作簡便、特異性強、靈敏度高、快速有效的TAV 檢測方法[14-15]。

實時熒光定量PCR 技術(shù)除了應(yīng)用于植物病毒病的檢測外，還可用于植物病原細(xì)菌的檢測。由Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Cmm ）引起的番茄細(xì)菌性潰瘍病是一種嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的種傳細(xì)菌性病害。夏明星等[9]根據(jù)ITS序列多態(tài)性設(shè)計引物及TaqMan探針進(jìn)行實時熒光PCR檢測的結(jié)果表明， 這組引物-探針能檢測出所有供試的Cmm菌， 對照菌均未檢測到熒光信號。用接種但未顯示癥狀的番茄苗葉片及人工處理的帶菌種子提取的核酸作為模板， 均能檢測到病菌， 其檢測靈敏度比常規(guī)PCR高約100倍。試驗中不需病原菌的分離培養(yǎng)及PCR的后續(xù)處理。該方法快速、簡便、安全、準(zhǔn)確， 適用于出入境檢驗檢疫及種子、種苗健康檢測領(lǐng)域[9，16]。

3.2 轉(zhuǎn)基因的檢測

轉(zhuǎn)基因作物自從1996 年進(jìn)行商品化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增長。番茄轉(zhuǎn)基因技術(shù)也得到長足發(fā)展。目前，實時熒光定量PCR已經(jīng)成功的應(yīng)用于檢測轉(zhuǎn)基因番茄的研究中。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要有兩個方面：一個是定性檢測，即看其是否為轉(zhuǎn)基因植株，另一方面是看轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)量即定量檢測。

Mason 等[17]通過研究番茄轉(zhuǎn)基因植株3個外源基因的表達(dá)證實，實時定量PCR 技術(shù)相比于Southern 雜交等其他技術(shù)而言，操作簡單，不需要特別的條件優(yōu)化，具有更為快速、準(zhǔn)確等特點。在定性檢測上，梁彥君等[18]利用實時定量PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)基因番茄華蕃一號中成功檢出35S、NOS、NPTII、35S-EFE 和內(nèi)參基因Lat52，陰性對照番茄合作903 中只有內(nèi)參基因Lat52 檢出，為我國番茄轉(zhuǎn)基因檢測提供參考。同時，比較了實時定量PCR與Nothern blot 技術(shù)的檢測結(jié)果，建立了一套更為精確、完善的檢測植物基因差異表達(dá)的PCR體系。王偉偉等[19]利用該技術(shù)對轉(zhuǎn)基因番茄中攜帶的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因進(jìn)行了檢測，避免了普通PCR經(jīng)常出現(xiàn)的假陽性， 具有準(zhǔn)確性。

在定量檢測上，Moon等[20]利用實時定量PCR技術(shù)有效地區(qū)分出轉(zhuǎn)基因番茄的外源基因在葉片、花和果實中RNA的轉(zhuǎn)錄水平。魏振林等[21]利用該技術(shù)研究了轉(zhuǎn)Mi1.2基因的番茄植株表達(dá)水平的檢測體系，為轉(zhuǎn)基因番茄植株的高通量篩選奠定基礎(chǔ)。

3.3 基因差異表達(dá)分析

如前所述，實時實量PCR檢測的靈敏度很高，所以該項技術(shù)也被用在了番茄中含量低的基因的檢測和定量研究上。miRNAs 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，參與了包括生物代謝、發(fā)育、疾病發(fā)生等各種重要的生理過程。該類RNA在生物體內(nèi)的表達(dá)水平存在明顯差異，且含量較低，傳統(tǒng)的檢測方法很難達(dá)到精確的檢測，而實時定量PCR的出現(xiàn)則為比較基因組學(xué)研究提供了可靠的方法和技術(shù)。劉辛等[22]利用stem-loop熒光定量RT-PCR，分析了黃瓜花葉病毒株系和番茄不孕病毒侵染番茄后，不同侵染時期、不同寄主組織中的7條miRNA及其部分靶標(biāo)mRNA對病毒侵染的響應(yīng)，探討了不同病毒與寄主互作過程中寄主miRNA調(diào)控途徑的改變和影響。謝小玉等[23]利用該項技術(shù)研究了番茄蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUT1）在不同栽培條件下不同器官的表達(dá)差異，為番茄的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)的建立提了理論依據(jù)。

4 討 論

隨著科技水平的不斷發(fā)展，越來越需要快速、有效、精確定量的技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)相對于傳統(tǒng)檢測技術(shù)優(yōu)勢更明顯。但由于實時熒光定量PCR技術(shù)也有其固有的缺點，如對設(shè)備要求較高，熒光探針成本較大，必須使用轉(zhuǎn)用耗材等，從而使得檢驗成本大大提高。所以一般的實驗室很難利用該技術(shù)。另外，實時熒光PCR技術(shù)對各反應(yīng)參數(shù)也要進(jìn)行嚴(yán)格的優(yōu)化，比如通過檢測SYBR Green 染料熒光而獲得的擴(kuò)增曲線有可能是非特異性擴(kuò)增，所以設(shè)計和篩選特異性引物可以大大降低其假陽性幾率。還有在PCR反應(yīng)加樣時DNA模板濃度不要太高，否則會抑制和干擾PCR反應(yīng)，使擴(kuò)增效率降低[24]。

雖然這項技術(shù)還存在著一些不足，但它的應(yīng)用前景還是令人鼓舞的。筆者相信隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，采用多領(lǐng)域多技術(shù)相結(jié)合的方法，可以實現(xiàn)單個技術(shù)所不能達(dá)到的研究水平和效果。實時定量PCR技術(shù)必將在番茄的各項研究領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 施林祥， 李東輝. 熒光PCR 研究新進(jìn)展[J]. World Chinese Journal of Digestology， 2005，13（5）：596-599.

[2] 高斌，劉敬忠.實時熒光PCR技術(shù)的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].診斷學(xué)理論與實踐，2005，4（6）：507-508.

[3] Mikael K A， Jose M A， Martin B，et al. The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine， 2006， 27：95-125.

[4] 田義軻，李節(jié)法，王彩虹，等.梨莖尖中PpKO基因表達(dá)量的實時熒光定量PCR分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2012（3）：62-66.

[5] 張華， 許叔祥. 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2000，23（2） ： 120-121.

[6] Clegg R M. Fluorescence resonance energy transfer[J]. Curt Opin.Biotechnol， 1995， 6（1）：103-110.

[7] Claire G， Ammaick M， Benedicte C. Real-time PCR： what relevance to plant studies？ [J]. Journal of Experimental Botany， 2004 ， 55 （402） ： 1 445-1 454.

[8] 易建平，劉素萍，印麗萍. Taqman-MGB探針在小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草黑穗病菌鑒定上的應(yīng)用[J].植物檢疫， 2005，19（1）：15-19.

[9] 夏明星， 趙文軍， 馬青， 等.番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測[J]. 植物病理學(xué)報，2006，36（2）： 152-157.

[10] 徐小剛，劉雅婷.實時熒光定量PCR在植物病害中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（7）：52-56.

[11] 朱建裕， 朱水芳， 廖曉蘭，等.實時熒光RT-PCR一步法檢測番茄環(huán)斑病毒[J].植物病理學(xué)報，2003，33（4）： 338-341.

[12] 林銘，胡鴻，杜永臣.番茄黃化曲葉病毒的實時熒光定量PCR檢測[J].中國蔬菜，2013（2）：20-26.

[13] 阮美穎，葉青靜，王榮青.TaqMan 探針實時熒光定量PCR 檢測番茄黃化曲葉病毒[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，24（5）：842-845.

[14] 譚鐘， 聞偉剛， 張吉紅，等.番茄不孕病毒實時熒光RT-PCR檢測方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2009，36（4）：655-658.

[15] Badillo I E， Rotenberg D， Schneweis D J，et al. Proteomic analysis of Frankliniella occidentalis and differentially expressed proteins in response to tomato spotted wilt virus infection[J]. J. Virol.， 2012， 86（16）：8 793.

[16] 吳興海，邵秀玲，鄧明俊.番茄潰瘍病菌實時熒光PCR快速檢測方法研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007， 19（3）：34-36.

[17] Mason G， Provero P， Vaira A M， et al. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR[J]. BMC Biotechnology， 2002（2）：20.

[18] 梁彥君，陳文虎，王夢娜，等. PCR結(jié)合核酸斑點雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因番茄研究[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報，2013，30（5）：747-752.

[19] 王偉偉， 朱長青， 劉小花，等.番茄葉片基因組DNA 快速制備技術(shù)及其在基于實時熒光定量PCR 的轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用[J].遺傳，2011，33（9）：1 017-1 022.

[20] Moon H， Callahany A M. Developmental regulation of peach ACC oxidase promoter GUS fusions in transgenic tomato fruits[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55：（402）： 1 519-1 528.

[21] 魏振林，田志環(huán)，焦傳珍，等. 轉(zhuǎn)基因番茄植株Mi1.2表達(dá)水平的Real Time PCR檢測體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（18）：7 589-7 590.

[22] 劉辛.番茄microRNA及其靶基因?qū)追N病毒侵染的反應(yīng)[D]. 杭州：浙江理工大學(xué)，2008.

[23] 謝小玉，尹永根，福田直也.實時定量PCR分析不同栽培措施下番茄蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（ SUT1）基因表達(dá)差異[J].中國蔬菜，2011（12）：25-31.

[24] 漆艷香，朱水芳，趙文軍，等.玉米細(xì)菌性枯萎病菌TaqMan 探針實時熒光PCR檢測方法的建立[J].植物保護(hù)學(xué)報，2004，31（1）：51-56.