無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在產(chǎn)前篩查中的應用價值

黃家亮 何浩瑜 黃威祥

摘要：目的? 探討無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)在產(chǎn)前篩查中的應用價值。方法? 選擇 2018年1月～2019年8月在我院自愿選擇無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的孕婦5000名，采集外周血漿應用高通量測序進行胎兒游離DNA檢測，高風險者行胎兒羊水染色體核型分析，并對5000名孕婦妊娠結(jié)局進行追蹤隨訪。結(jié)果? 發(fā)現(xiàn)57名孕婦有異常情況，其中21-三體31名，假陽性2名;18-三體5名，假陽性3名;13-三體4名，假陽性3名;性染色體異常17名，假陽性7名。隨訪顯示21-三體假陰性1名。結(jié)論? 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)用于胎兒染色體非整倍體尤其是21-三體的檢測具有較高的準確性，但對于其他非整倍體檢測的準確性還有待進一步提高。

關(guān)鍵詞：無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測;染色體;非整倍體;高通量測序技術(shù)

Abstract：Objective? To explore the application value of noninvasive prenatal genetic testing technology in prenatal screening.Methods? Choose 5000 pregnant women who voluntarily choose noninvasive prenatal genetic testing in our hospital from January 2018 to August 2019，collect peripheral plasma and use high-throughput sequencing to detect fetal free DNA， and perform karyotype analysis of the fetal amniotic fluid chromosomes in high risk individuals， and follow-up of 5000 pregnant women's pregnancy outcomes.Results 57 pregnant women were found to have abnormalities， including 21-trisomy 31， 2 false positives; 18-trisomy 5， 3 false positives; 13-trisomy 4， 3 false positives; 17 sex chromosome abnormalities ， 7 false positives. Follow-up showed 21-trisomy 1 false negative.Conclusion? The noninvasive prenatal gene detection technology used in the detection of fetal chromosomal aneuploidy， especially 21-trisomy， has high accuracy， but the accuracy of other aneuploidy detection needs to be further improved.

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)是通過采集孕婦的外周血，利用二代測序技術(shù)對母體血漿中的游離DNA片段（平均長度166 kb）測序，對測序結(jié)果進行生物信息學分析，從而獲取胎兒的遺傳信息，以評估胎兒患染色體非整倍體的風險。2012年9月12日，衛(wèi)生部發(fā)布的《中國出生缺陷防治報告（2012）》指出，我國出生缺陷發(fā)生率與世界中等收入國家的平均水平接近，約為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例，染色體非整倍體疾病是胎兒畸形中較為常見的疾病，在胎兒畸形占比中高達1/60，所以對孕婦進行染色體非整倍體產(chǎn)前檢查具有十分重要的意義。目前，許多國內(nèi)醫(yī)療機構(gòu)相繼采用了無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)進行染色體非整倍體方面的檢測，認為該技術(shù)對染色體非整倍體具有很高的準確性?；诖?，本文對無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)在貴港地區(qū)產(chǎn)前篩查的應用情況進行分析，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象? 選擇 2018年1月～2019年8月在貴港市婦幼保健院遺傳咨詢后充分了解無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體基因檢測技術(shù)的前提下，簽署知情同意書，自愿選擇無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的5000名孕婦作為研究對象。孕婦年齡18～43歲，孕周12～24周，≥35歲高齡孕婦1530名（30.60%）。

1.2無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)? 配套專用K管抽取孕婦靜脈血5 ml，冷凍離心機4 ℃條件下1600 r/min離心10 min，16000 r/min離心10 min兩步法分離血漿，提取血漿中游離DNA，PCR擴增，制備混合文庫，制作納米球，利用聯(lián)合探針錨定聚合測序法進行測序，對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，參照正常人群數(shù)據(jù)庫計算Z值來評估胎兒患染色體非整倍體的風險。

1.3胎兒羊水染色體核型分析? 通過絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺和臍帶血穿刺進行染色體核型分析是判斷胎兒染色體異常的“金標準”[1]。胎兒羊水染色體核型分析按照 2010年衛(wèi)生部《胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準第2部分：胎兒染色體異常的細胞遺傳學產(chǎn)前診斷技術(shù)標準》執(zhí)行。孕婦術(shù)前需排空膀胱，取仰臥位，B超儀實時引導下行羊膜腔穿刺，無菌抽取羊水，分裝于2支15 ml管心管置離心機1500 r/min下離心10 min，棄上清液余2～3 ml沉淀，沉淀與兩種不同的羊水培養(yǎng)液混勻后分別接種于2個培養(yǎng)瓶，分別置于2個溫度為37 ℃，CO2濃度5%的培養(yǎng)箱中7 d，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，鏡下可見多于5個克隆細胞時換液，使用無菌細胞刮刮下克隆，混勻繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，當羊水細胞貼壁生長旺盛，加20 μg/ml秋水仙素3 h后收獲細胞，溫度28 ℃，濕度70%環(huán)境下制片，G顯帶后使用蔡司全自動掃描系統(tǒng)進行染色體核型分析。

1.4觀察指標? 對無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果為-3

2結(jié)果

選擇無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的5000名孕婦中57名篩查為高風險，陽性率1.14%。21-三體31例（0.62%），18-三體5例（0.10%），13-三體4例（0.08%），性染色體非整倍體異常17例（0.34%）。其中55名選擇了羊水產(chǎn)前診斷（產(chǎn)前診斷率96.49%），確診21-三體28例，18-三體2例，13-三體1例。2例未行產(chǎn)前診斷的孕婦隨訪均為性染色體非整倍體陰性，隨訪中發(fā)現(xiàn)1例21-三體假陰性。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測方法的21-三體的檢出率為96.55%（28/29），陽性預測值90.32%（28/31），假陽性率0.06%（3/4971）;18-三體的檢出率100.00%（2/2），陽性預測值40.00%（2/5），假陽性率0.06%（3/4998）;13-三體的檢出率100.00%（1/1），陽性預測值25.00%（1/4），假陽性率0.06%（3/4999）;性染色體非整倍體的檢出率100.00%（8/8），陽性預測值53.33%（8/15），假陽性率0.18%（9/4992）。

3討論

染色體異常（包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常）是引起出生缺陷的主要原因，臨床上常見的染色體疾病有唐氏綜合征（21-三體）、愛德華綜合征（18-三體）、帕陶氏綜合征（13-三體）、特納綜合征（45，X）、克氏綜合征（47，XXY），大約占產(chǎn)前診斷疾病的80%[2]。這類染色體疾病主要表現(xiàn)為智力低下、生長發(fā)育遲緩、或合并有其他臟器多種畸形，患有這類病癥的兒童無疑給家庭和社會帶來了巨大的負擔。

目前染色體病并沒有根治的方法，唯一有效的措施為采取產(chǎn)前篩查和診斷的方式來減少患病胎兒的出生。對于染色體疾病的篩查，目前我國普遍使用的兩聯(lián)、三聯(lián)唐氏血清學產(chǎn)前篩查，以及聯(lián)合B超的綜合篩查，檢出率只有60%～80%，假陽性率高達5%。研究發(fā)現(xiàn)[3]，產(chǎn)前篩查高風險人群染色體異常發(fā)生率僅為2.14%，說明大多數(shù)的孕婦可能會被過度產(chǎn)前診斷。不同的唐氏篩查組合仍有5%～50%的漏診率，漏診多發(fā)生在唐氏篩查臨界風險的孕婦中，鄭文吉等[4]研究發(fā)現(xiàn)，寧波市2012～2014年156498例孕婦中唐氏綜合癥假陰性14例，其中臨界風險占10例。Lewis C等[5]研究發(fā)現(xiàn)，20.1%的唐氏篩查為臨界風險的孕婦感到焦慮，其希望獲得安全、準確的進一步檢查。臨床上對胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷主要是絨毛膜穿刺、羊水穿刺和臍帶血穿刺的介入性產(chǎn)前診斷，但介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)具有一定的操作危險性，可能導致胎兒宮內(nèi)感染以及流產(chǎn)等不良后果，其中流產(chǎn)率高達1%[6]，同時也給孕婦造成極大的心理負擔。介入性診斷技術(shù)還需進行細胞培養(yǎng)，TAT較長。因此，尋求安全、快速、準確的產(chǎn)前診斷技術(shù)是優(yōu)生優(yōu)育的要求。隨著2016年我國二胎政策的全面放開，大量的高齡孕婦均需產(chǎn)前診斷，現(xiàn)有的衛(wèi)生資源將無法滿足日益增加的產(chǎn)前診斷需要。

近年來，隨著居民生活水平的提高和優(yōu)生優(yōu)育意識的加強，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)得以高速發(fā)展。Lo YM等[7]研究證實在孕婦的血漿中存在有胎兒游離 DNA 片段，為無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)提供了依據(jù)。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測通過對母體血漿中游離胎兒DNA進行高通量測序，可將唐氏綜合征、愛德華綜合征、帕陶氏綜合征的檢出率分別提升至99%、96%、91%，假陽性率從5%降至0.35%[8]。孕婦本人及家屬顧忌有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷方法對胎兒和孕婦的影響，使得無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)成為多數(shù)孕婦的選擇。雖然無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測被認為是一種精準的產(chǎn)前檢測技術(shù)，對于21-三體、18-三體、13-三體及性染色體非整倍體具有較高的準確性，可減少大量不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，但同時無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)存在著檢測假陽性和假陰性的問題，所以并不能取代介入性產(chǎn)前診斷。如何降低其假陽性、避免假陰性已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。本次研究發(fā)現(xiàn)，57例高風險孕婦中有16例胎兒羊水染色體核型分析結(jié)果正常，也說明了無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)存在假陽性問題。引起假陽性的主要原因有限制性胎盤嵌合、母體染色體嵌合、母體或胎兒基因組中拷貝數(shù)變異、雙胎中一胎停育、母體存在惡性腫瘤等。因此在臨床產(chǎn)前檢查工作中，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測只能作為傳統(tǒng)血清學篩查方法的有益補充[9]，胎兒染色體診斷還應以細胞遺傳學為主。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)檢測21-三體的準確率最高，18-三體、13-三體和性染色體非整倍體的準確率均不高，與夏開德等[10]的研究結(jié)果類似，這必造成一部分孕婦因假陽性問題而選擇介入性產(chǎn)前診斷。因此，臨床上應重視對假陽性問題的處理。

綜上所述，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測對于檢測21-三體有高準確性，而且具有無創(chuàng)性的優(yōu)點，但對于18-三體、13-三體及性染色體非整倍體異常的檢測準確性還有待提高。在臨床工作中使用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測前要充分掌握臨床應用指征與做好遺傳咨詢工作，有效指導優(yōu)生優(yōu)育、降低出生缺陷兒和提高人口素質(zhì)。

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收稿日期：2019-10-17;修回日期：2019-11-05

編輯/錢洪飛