Th22、Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子在子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中的表達(dá)及意義

王連云　張瓊　金栩冰　熊文棟　葉文　王繁

[摘要] 目的 通過(guò)檢測(cè)子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR、Foxp3及細(xì)胞因子IL-22、IL-10的表達(dá)，探討其在子癇前期中的作用。 方法 選取35例明確診斷的子癇前期孕婦為研究組，同時(shí)選取正常妊娠孕婦35例為對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組孕婦胎盤(pán)組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)情況;采用免疫組化檢測(cè)細(xì)胞因子IL-22、IL-10的表達(dá)。 結(jié)果 AHR mRNA在研究組和對(duì)照組的表達(dá)量分別為（1.85±0.47）和（0.89±0.26），F(xiàn)oxp3 mRNA在兩組的表達(dá)量分別為（0.76±0.23）和（1.31±0.42），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-22在研究組和對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.57%和40.00%，IL-10在兩組的表達(dá)率為34.29%和60.00%，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 Th22、Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的異常表達(dá)，可能參與了子癇前期的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 子癇前期;Th22細(xì)胞;調(diào)節(jié)T細(xì)胞;轉(zhuǎn)錄因子;細(xì)胞因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714.244? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）05-0038-04

Expression and significance of Th22， Treg cell transcription factors and cytokines in placenta tissue of preeclampsia pregnant women

WANG Lianyun? ZHANG Qiong? JIN Xubing? XIONG Wendong? YE Wen? WANG Fan

Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? 325027， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factors AHR， Foxp3， and cytokines IL-22 and IL-10 in the placenta of preeclampsia pregnant women， and to explore their role in preeclampsia. Methods Thirty-five definite pregnant women with preeclampsia were selected as the study group， while 35 normal pregnant women were selected as the control group. The Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factor AHR mRNA and Foxp3 mRNA expressions in placental tissues of two groups of pregnant women were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The cytokine IL-22 and IL-10 expressions were detected by immunohistochemical method. Results The expression levels of AHR mRNA in the study group and control group were（1.85±0.47） and （0.89±0.26）， respectively. The expression levels of Foxp3 mRNA in the two groups were （0.76±0.23） and （1.31±0.42）， and the differences were statistically significant. The positive expression rates of IL-22 in the study group and control group were 68.57% and 40.00%， respectively. The expression rates of IL-10 in the two groups were 34.29% and 60.00%， and the differences were also statistically significant. Conclusion The abnormal expression of Th22 and Treg cell transcription factors and cytokines may be involved in the occurrence of preeclampsia.

[Key words] Preeclampsia; Th22 cells; Regulatory T cells; Transcription factors; Cytokines

子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠與血壓升高并存的一種疾病，發(fā)生率約為5%左右，可致孕產(chǎn)婦多器官功能損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致子癇甚至孕產(chǎn)婦和圍生兒的死亡，是造成孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1，2]。近年來(lái)，隨著我國(guó)二胎政策的開(kāi)放，高危妊娠產(chǎn)婦明顯增多，子癇前期的發(fā)病率也呈逐漸升高趨勢(shì)[3]。到目前為止，PE的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)的研究初步表明免疫功能紊亂是PE發(fā)生的一個(gè)重要原因，PE孕婦往往存在炎癥免疫過(guò)度的激活[4]。目前免疫因素的研究主要集中在Toll樣受體家族、蛻膜自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等方面，而子癇前期特異性免疫研究集中在T淋巴細(xì)胞，研究表明在PE孕婦中存在著T淋巴細(xì)胞的免疫異常[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)PE孕婦胎盤(pán)組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR（芳香烴受體）、Foxp3（叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子）mRNA及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22、IL-10的表達(dá)情況，以探討其在PE發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年11月～2019年5月在我院定期產(chǎn)檢、診斷、住院治療直至分娩的PE孕婦35例為研究組;搜集同期在我院定期產(chǎn)檢并住院分娩的正常妊娠孕婦，其孕周、年齡與研究組相近、產(chǎn)檢無(wú)異常且隨訪至產(chǎn)后42 d亦無(wú)異常的健康孕婦35例為對(duì)照組。所有入選孕婦孕前均無(wú)內(nèi)外科疾病，均為單胎妊娠，且無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。PE的診斷嚴(yán)格按照謝幸、孔北華、段濤主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[6]。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 取材方法? 所有入組孕婦在胎盤(pán)娩出后立即采集胎盤(pán)組織：于胎盤(pán)中央母體面取大小約1 cm×1 cm×1 cm組織，避開(kāi)出血、壞死、鈣化區(qū)，使用生理鹽水沖洗后，置入經(jīng)DEPC處理的EP管中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱待統(tǒng)一檢測(cè)。同法再取約1 cm×1 cm×1 cm 大小的胎盤(pán)組織，應(yīng)用生理鹽水充分漂洗，10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片，保存，待統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2.2 主要儀器和試劑? ABI7500 PCR系統(tǒng)及SYBRgreen I購(gòu)自美國(guó)ABI公司;紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)默克生物科技公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;免疫組化儀器購(gòu)自美國(guó)羅氏公司;免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)? 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定其在260 nm和280 nm的吸光度，計(jì)算RNA純度，使RNA的純度符合要求。利用瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，再將所得到的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶10 μL，模板10 μL，雙蒸水7.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán);95℃ 10 min，95℃ 15 s，;61℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。采用ABI7500 PCR系統(tǒng)及SYBRgreen I染料法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，采用β-actin 作為內(nèi)參照。GenBank上查找目的基因mRNA序列，引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)（表1），由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)兩組孕婦胎盤(pán)組織中細(xì)胞因子IL-22、IL-10 的表達(dá)? 所有標(biāo)本采用免疫組化檢測(cè)IL-22和IL-10的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。IL-22和IL-10在胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用半定量評(píng)分法，400倍鏡下任意觀察5個(gè)視野。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)及顏色的強(qiáng)度，分為①陰性（-）：0分;②弱陽(yáng)性（+）：l～4分;③中等陽(yáng)性（++）：5～8分;④強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：9～12分[7]。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄兩組孕婦年齡、分娩孕周、收縮壓、舒張壓、尿蛋白及新生兒出生體重等情況;記錄轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA在兩組孕婦胎盤(pán)中的表達(dá)情況，其中基因表達(dá)采用2-ΔCT法比較，ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因;并記錄兩組孕婦細(xì)胞因子IL-22、IL-10在胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦臨床資料比較

研究組孕婦和對(duì)照組孕婦年齡、分娩孕周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;研究組孕婦收縮壓、舒張壓及尿蛋白較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而研究組新生兒出生體重明顯低于對(duì)照組，其差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.2 兩組孕婦胎盤(pán)組織中Th22、Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達(dá)水平比較

研究組孕婦胎盤(pán)組織中Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA的表達(dá)量為（1.85±0.47），對(duì)照組孕婦胎盤(pán)組織中的Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AHR mRNA的表達(dá)量為（0.89±0.26），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;而Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)量在研究組中明顯低于對(duì)照組，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表3）。

2.3 兩組孕婦胎盤(pán)組織中細(xì)胞因子IL-22、IL-10的表達(dá)水平比較

本研究結(jié)果顯示，IL-22在研究組孕婦胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.57%，明顯高于其在對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;IL-10在研究組孕婦胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

3 討論

妊娠被認(rèn)為是一種成功的半同體移植，一次成功的妊娠需要母胎間免疫平衡的維持，這種免疫平衡的破壞是妊娠期高血壓疾病發(fā)生的一個(gè)重要原因。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)娩出后子癇前期的病情往往得到較快的緩解，因此，胎盤(pán)被認(rèn)為是子癇前期發(fā)生的始發(fā)病灶。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞在子癇前期孕婦中存在異常分化，致使子癇前期孕婦出現(xiàn)異常的T細(xì)胞免疫及其功能因子的異常分泌[8]，這可能是導(dǎo)致子癇前期發(fā)生的重要原因。

AHR屬于異二聚體轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的堿性螺旋-環(huán)-螺旋超家族中新發(fā)現(xiàn)的PAS亞家族中的一種，是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)于哺乳動(dòng)物的肝臟、皮膚、肺、消化道、黏膜上皮細(xì)胞和胎盤(pán)等組織上[9-10]。在T細(xì)胞的分化過(guò)程中，通過(guò)AHR的作用，能使初始T細(xì)胞向Th22細(xì)胞分化，但這個(gè)過(guò)程受到其他細(xì)胞因子的影響：如IL-6、TNF-α可以促進(jìn)Th22細(xì)胞的分化，而IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等則會(huì)抑制Th22細(xì)胞的分化[11-12]。Th22細(xì)胞是最新發(fā)現(xiàn)的一群在功能和分化上獨(dú)立的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，其能分泌特征性的功能因子IL-22。IL-22由活化后的T 細(xì)胞產(chǎn)生，Th17細(xì)胞、Th22 等均可能產(chǎn)生IL-22，但在所有分泌IL-22的T細(xì)胞亞群中，Th22細(xì)胞所占比例為37%～63%。Th22細(xì)胞分泌的IL-22與自身功能的發(fā)揮密切相關(guān)，Th22細(xì)胞主要是通過(guò)IL-22發(fā)揮功能[13-14]。目前的研究表明，Th22 細(xì)胞、IL-22在自身免疫性疾病、感染性疾病、炎癥性腸病及惡性腫瘤中均發(fā)揮著重要的作用[15-17]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦胎盤(pán)組織中AHR mRNA異常高表達(dá)，IL-22亦異常高表達(dá)，提示Th22細(xì)胞在子癇前期孕婦中存在異常表達(dá)，這種免疫紊亂可能是子癇前期的發(fā)生原因，但是具體作用方式及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

Treg細(xì)胞是一類(lèi)高表達(dá)CD4、CD25，低表達(dá)CD127，分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的細(xì)胞亞群，在抑制自身免疫性疾病、介導(dǎo)異體器官移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用[18]，其能夠在母胎界面直接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box protein-3，F(xiàn)oxp3）是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，在Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持中起著重要作用[19]。Treg細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，IL-10是其中一種。近年來(lái)研究顯示子癇前期孕婦外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量與正常妊娠者相比明顯減少[20]，因此推測(cè)Foxp3 的表達(dá)下降可能與Treg細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。本研究顯示，F(xiàn)oxp3 mRNA在子癇前期孕婦胎盤(pán)中的表達(dá)較正常妊娠孕婦明顯下降，這與范月蓮等[21]研究結(jié)果一致，且我們的研究亦提示Treg細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-10在胎盤(pán)中的表達(dá)亦明顯下降，提示在子癇前期孕婦中存在Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的表達(dá)失衡，考慮其參與子癇前期的發(fā)生。

綜上所述，Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子在子癇前期孕婦胎盤(pán)中高表達(dá)，而Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子在子癇前期孕婦中低表達(dá)，提示Th22、Treg細(xì)胞在子癇前期孕婦中存在表達(dá)失衡與紊亂，這種免疫紊亂可能是子癇前期的發(fā)生原因，深入研究其變化規(guī)律及作用機(jī)制，對(duì)明確子癇前期的發(fā)生原因有重要意義。

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（收稿日期：2019-10-24）