槐耳醇提物的抗氧化降血糖活性

蘇偉，陳盛芳，施昊卿，宋康馨，李超*

徐州工程學院食品工程學院（徐州 221018）

槐耳（Trametes robiniophila），多孔菌科多年臥孔菌屬[1]，分布于河北、山東、陜西、江蘇等地[2]?；倍哂性鰪娙梭w免疫功能[3]、抗腫瘤[4]和抗病毒[5]等多種功效。已有的文獻報道多是關于槐耳多糖，而關于槐耳多酚功效的研究很少，為此，此次試驗研究槐耳醇提物的抗氧化活性和降血糖活性，為擴大開發(fā)其食醫(yī)藥用功效提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

槐耳，安國市旭芳中藥材經營有限公司；蘆丁，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；兒茶素，中國藥品生物制品檢定所；TPTZ（2, 4, 6-三（2-吡啶基）三嗪），上海伊卡生物技術有限公司；ABTS（2, 2-聯氮雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽），合肥博美生物科技有限公司；p-DMACA（對二甲氨基肉桂醛），上海原葉生物科技有限公司；α-淀粉酶，美國Sigma-aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 設備與儀器

ZHBE-50型閃式提取器，河南智晶生物科技發(fā)展有限公司；L550型低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；7230G型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；LGJ-10型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠；Synergy H1型全功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 槐耳醇提物的制備

原料→烘干（60℃）→粉碎→過篩（100目）→浸泡（60%乙醇，液料比8∶1 mL/g，12 h）→閃式提?。妷?0 V，每次60 s，提取3次）→離心（4 000 r/min，20 min）→抽濾→濃縮（50℃）→冷凍干燥→槐耳醇提物粉

1.3.2 醇提物成分含量的測定

1.3.2.1 多酚含量測定

采用福林酚法[6]。將2.5 mL不同濃度沒食子酸溶液、1 mL Folin-Ciocalteu試劑和3 mL的碳酸鈉溶液（10 g/100 mL）混合，添加純凈水定容至25 mL，晃勻，30℃放置1.5 h，750 nm處測定吸光度。以沒食子

酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.165 7x-0.000 4（R2=0.995 9）。

1.3.2.2 黃酮含量測定

采用NaNO2-Al3+-NaOH法[7]。將5.4 mL不同濃度蘆丁溶液和3 mL亞硝酸鈉溶液（5 g/100 mL）混合，晃勻，37℃下避光6 min；然后加入0.3 mL Al(NO3)3溶液（10 g/100 mL），晃勻，37℃下避光6 min；最后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液后定容至10 mL，晃勻，37℃下避光10 min，510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.010 9x-0.009 4（R2=0.999 0）。

1.3.2.3 黃酮醇含量測定

采用氯化鋁醋酸鈉法[8]。將2.0 mL不同濃度蘆丁溶液、2.0 mL AlCl3溶液（2 g/100 mL）和6 mL醋酸鈉溶液（5 g/100 mL）混合，晃勻，20℃下避光反應2.5 h，440 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.022 6x- 0.001 8（R2=0.999 7）。

1.3.2.4 黃烷醇含量測定

采用p-DMACA鹽酸法-兒茶素法[9]。將1.0 mL不同濃度兒茶素溶液和3 mLp-DMACA溶液混合，晃勻，37℃下避光反應20 min，640 nm處測定吸光度。以兒茶素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.085 5x+0.024 2（R2=0.996 3）。

1.3.2.5 酚酸含量測定

按參考文獻[10]方法稍有修改。將2.0 mL不同濃度沒食子酸溶液、800 μL SDS溶液（0.3 g/100 mL）、400 μL氯化鐵（0.6 g/100 mL）和六氰合鐵酸鉀（0.9 g/100 mL）的混合液（按比例10∶9混合）混合，晃勻，室溫下避光反應5 min，添加純凈水定容于10 mL，晃勻，室溫下避光反應20 min，743 nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.563 3x+0.007 2（R2=0.996 4）。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 鐵離子還原抗氧化力試驗

按參考文獻[11]方法稍有修改。

1) FRAP試劑的配制：A液為10 mmol/L的TPTZ溶液；B液為20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液；C液為pH 3.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，按1∶1∶10體積比混合，配成FRAP工作液，現配現用。

2) FeSO4標準曲線繪制：分別吸取0，0.35，0.50，0.65，0.80，0.95和1.10 mL FeSO4·7H2O溶液（1.052 mg/mL）于試管中，添加純凈水定容至10 mL；再分別取0.3 mL的上述溶液和3.7 mL FRAP工作液混合，晃勻，37℃避光反應10 min，以空白組為參比，593 nm處測定吸光度。以FeSO4·7H2O毫摩爾濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.023 7x-0.001 6（R2=0.997 8）。

3) 試樣的測定：將0.3 mL不同濃度槐耳醇提物溶液和3.7 mL的FRAP工作液于試管中混合，晃勻，37℃下避光10 min，以空白管為參比，593 nm處測其吸光度。VC作為陽性對照。

4) 評價：試樣總抗氧化能力以FRAP值表示，即達到同樣吸光度所需的FeSO4·7H2O溶液的摩爾濃度（μmol/L），FRAP值越大，抗氧化活性越強。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除試驗

按參考文獻[12]方法稍有修改。

1) ABTS+工作液的配制：A液為7 mmol/L ABTS溶液；B液為140 mmol/L K2S2O8溶液；將10 mL A液和176 μL B液混勻，室溫避光過夜12～16 h，該溶液即為ABTS+儲備液。將生成的ABTS+儲備液用純凈水稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.850±0.050，即得ABTS+工作液。

2) 試樣的測定：將1.0 mL不同濃度槐耳醇提物溶液和4 mL ABTS+工作液依次加入到試管，晃勻，37℃下避光反應60 min，734 nm處測定吸光度，記作Ai；采用純凈水代替槐耳醇提物溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Ac；采用純凈水代替ABTS+工作液，重復上述過程，測定吸光度，記作Aj。測定上述3種吸光度，以純凈水作參比。清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

1.3.3.3 總還原力試驗

按參考文獻[13]方法稍有修改。將0.5 mL不同濃度槐耳醇提物溶液、1.25 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）和1.25 mL K3[Fe(CN)6]溶液（1 g/100 mL）依次加入到試管，晃勻，50℃避光反應20 min；添加1.25 mL三氯乙酸（10 g/100 mL）終止反應；3 000 r/min離心10 min；取上清液，添加4.25 mL純凈水和0.85 mL FeCl3溶液（0.1 g/100 mL），晃勻，700 nm處測定吸光度，記作Ai；采用純凈水代替試樣溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Ac；A還原力=Ai-Ac。用純凈水作為參比，用VC作為陽性對照。A還原力越大，還原力越強，抗氧化活性越強。

1.3.3.4 總抗氧化試驗

按參考文獻[14]方法稍有修改。A液為0.6 mol/L濃硫酸溶液；B液為28 mmol/L磷酸鈉溶液；C液為4 mmol/L鉬酸銨溶液；將A、B和C等體積混勻即得磷鉬試劑。將1.0 mL不同濃度槐耳醇提物溶液和3.0 mL的磷鉬試劑依次加入到試管，晃勻，95℃反應90 min，放冷至室溫，695 nm處測定吸光度，記作Ai；采用純凈水代替試樣溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Ac；A總抗氧化=Ai-Ac。用純凈水作為參比，用VC作為陽性對照。A總抗氧化越大，還原力越強，抗氧化活性越強。

1.3.4 抑制α-淀粉酶活性測定

按參考文獻[15]方法稍有修改。在10 mL容量瓶中依次添加0.7 mL不同濃度槐耳醇提物溶液和0.6 mL 1%可溶性玉米淀粉溶液；晃勻，37℃預熱5 min；再加入0.2 mL 20 U/mLα-淀粉酶溶液（提前37℃預熱5 min）；晃勻，37℃避光反應5 min；加入0.5 mL 1% DNS溶液，晃勻，100℃避光反應5 min，冷卻，定容至10 mL，540 nm處測定吸光度，記作Ai；采用磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，PBS）代替槐耳醇提物溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Ac；采用PBS代替α-淀粉酶溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Aj；采用PBS代替α-淀粉酶溶液，重復上述過程，測定吸光度，記作Ad。以阿卡波糖為陽性對照，純凈水為參比。抑制率=[1-（Ai-Aj）/（Ac-Ad）]×100%。

1.4 數據分析

IC50值采用PASW Statistics 18.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 成分分析

槐耳醇提物的多酚含量為103.62 mg PE/g FDW，總黃酮含量為195.64 mg RE/g FDW，總黃酮醇含量為1.50 mg RE/g FDW，總黃烷醇含量為203.20 mg CE/g FDW，總酚酸含量為43.79 mg PE/g FDW。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 鐵離子還原抗氧化力

由圖1可知，FRAP值與槐耳醇提物濃度在1.8～ 16.2 μg/mL范圍內呈正相關，隨著濃度的增加，FRAP值也隨之增加。在槐耳醇提物1.8 μg/mL時，有最小的FRAP值，為3.63；在16.2 μg/mL時，有最大的FRAP值，為32.00。當VC和槐耳醇提物取相同濃度時，VC有更高的FRAP值，說明VC的鐵離子還原抗氧化力強于槐耳醇提物。

圖1 鐵離子還原抗氧化

2.2.2 ABTS+自由基清除

由圖2可知，ABTS+自由基清除率與槐耳醇提物濃度在3～30 μg/mL范圍內呈正相關，隨著濃度的增加，清除率也隨之增加。在槐耳醇提物3 μg/mL時，有最小的清除率（21.92%）；在30 μg/mL時，有最大的清除率（92.86%）?；倍继嵛锏腎C50值為8.88 μg/mL；VC的IC50值為2.34 μg/mL，說明VC清除ABTS+自由基的能力強于槐耳醇提物。

圖2 ABTS+自由基清除活性

2.2.3 總還原力

由圖3可知，A還原力值與槐耳醇提物濃度在2～20 μg/mL范圍內呈正相關，隨著濃度的增加，A還原力也隨之增加。在槐耳醇提物2 μg/mL時，有最小的A還原力，為0.202；在20 μg/mL時，有最大的A還原力，為0.540。當VC和槐耳醇提物取相同濃度時，VC有更高的A還原力，說明VC的總還原力強于槐耳醇提物。

圖3 總還原力

2.2.4 總抗氧化

由圖4可知，A總抗氧化值與槐耳醇提物濃度在15～ 150 μg/mL范圍內呈正相關，隨著濃度的增加，A總抗氧化也隨之增加。在槐耳醇提物15 μg/mL時，有最小的A總抗氧化，為0.101；在150 μg/mL時，有最大的A總抗氧化，為0.862。當VC和槐耳醇提物取相同濃度時，VC有更高的A總抗氧化，說明VC的總抗氧化強于槐耳醇提物。

2.3 抑制α-淀粉酶活性分析

由圖5可知，α-淀粉酶抑制率與槐耳醇提物濃度在0.28～2.24 mg/mL范圍內呈正相關，隨著濃度的增加，其對α-淀粉酶的抑制率也隨之增加。在槐耳醇提物0.28 mg/mL時，有最小的抑制率，為44.87%；在2.24 mg/mL時，有最大抑制率，為93.87%。槐耳醇提物的IC50值為0.447 mg/mL，阿卡波糖的IC50值為2.76 mg/mL，說明槐耳醇提物抑制α-淀粉酶的能力比阿卡波糖強，有更高效的降血糖作用。

圖4 總抗氧化

圖5 抑制α-淀粉酶活性

3 結論

槐耳醇提物中多酚含量為103.62 mg PE/g FDW、黃酮含量為195.64 mg RE/g FDW、黃烷醇含量為203.2 mg CE/g FDW、黃酮醇含量為1.50 mg RE/g FDW、酚酸含量為43.79 mg PE/g FDW?？寡趸钚灾?，其鐵離子還原抗氧化能力在1.8～16.2 μg/mL范圍內FRAP值為3.63～32.00；清除ABTS+自由基能力在3～30 μg/mL范圍內清除率為21.92%～92.86%；總還原力在2～20 μg/mL范圍內A還原力為0.202～0.540；總抗氧化力在15～150 μg/mL范圍內A總抗氧化為0.101～0.862，表明槐耳醇提物具有較強的抗氧化能力。通過抑制α-淀粉酶活性的強弱來表達其降血糖能力的大小，槐耳醇提物濃度在0.28～2.24 mg/mL范圍內抑制率為44.87%～93.87%，IC50值為0.447 mg/mL，阿卡波糖的IC50值為2.76 mg/mL，表明槐耳醇提物抑制α-淀粉酶活性的能力更強，有更高效的降血糖作用?；倍继嵛锞哂辛己玫目寡趸芰透咝У慕笛悄芰Γ勺鳛橹苽淇寡趸＝∑泛徒笛撬幬锏脑?，有著廣闊的開發(fā)利用空間和巨大的市場潛力。