杜仲健骨方對大鼠骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制研究

邢威,陳雁雁,王樹人,王艷麗,王文姌,張洪財(cái),孫秋

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校，黑龍江 哈爾濱 150301； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性、骨代謝性骨骼疾病。主要表現(xiàn)為骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞的全身性骨量減少。本病多發(fā)于中老年，尤其是絕經(jīng)期后女性為高發(fā)人群，提示本病的發(fā)生與雌激素水平密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，OP患者群骨脆性增加，加重腕關(guān)節(jié)、脊柱和髓關(guān)節(jié)[1-2]骨折風(fēng)險(xiǎn)。隨著社會的進(jìn)步，人口壽命的增加、結(jié)構(gòu)的改變，人口趨于老齡化，發(fā)病率呈上升趨勢，對OP患者的健康構(gòu)成威脅[3]。骨質(zhì)疏松癥根據(jù)其病因病機(jī)以及臨床所表現(xiàn)等可以歸屬于中醫(yī)學(xué)中的“骨痹”、“骨痿”范疇[4-5]。

根據(jù)中醫(yī)“腎主骨生髓”、“久病及腎”、“腎虛是骨質(zhì)疏松癥的病理基礎(chǔ)”等理論，擬定出臨床有效的經(jīng)驗(yàn)方杜仲健骨方。杜仲健骨組方：杜仲、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、懷牛膝。方解：杜仲、淫羊藿補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨，腎陽推動精血運(yùn)行，共為君藥。補(bǔ)骨脂、懷牛膝溫腎助陽，共為臣藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎陽、填髓健骨之功效。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：大鼠體質(zhì)量增加與骨礦密度成正相關(guān),能夠降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)；子宮指數(shù)明顯升高,提示該方可能有類激素樣作用,可預(yù)防因卵巢切除或卵巢功能下降。這與此前運(yùn)用補(bǔ)腎健筋骨法治療骨質(zhì)疏松癥的報(bào)道相符[6-8]。本研究通過測定骨組織Wnt3a、β-catenin基因、蛋白表達(dá)，探討杜仲健骨方對大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，雌性，來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心(GLP)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2018-007。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑

杜仲健骨方：杜仲35 g、淫羊藿25 g、補(bǔ)骨脂15 g、懷牛膝15 g組成，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局提供，并由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慧峰教授鑒定為正品；阿侖膦酸鈉片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)提供，國藥準(zhǔn)字：H20065637，產(chǎn)品批號：190124)；血清堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨鈣素(OC)和I型原膠原N-端前肽(PINP)測定試劑盒(上海哈研生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：201903)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；裂解液 RL、RIPA 裂解液(北京百泰克生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；PVDF膜(英國Whatman)；抗體及上、下游引物(美國Invitrogen公司)。

1.3 主要儀器

Bio-Rad iQ5實(shí)時熒光定量PCR儀(美國伯樂)、Western blot電泳槽、垂直電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)；KHW-S-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(杭州億捷科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)；MEDIX90雙能X線測量儀(法國Medlnk公司)。

2 方法

2.1 模型的制備與分組給藥

按照文獻(xiàn)[9-11]方法并略加改進(jìn)制備大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，取3%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射，待大鼠麻醉后，在劍突下剪毛(面積約4 cm×3 cm)；用75%(φ)酒精對手術(shù)部位進(jìn)行消毒，于劍突下1.5 cm處，沿腹白線做縱向切口(約2 cm)，暴露腹腔。尋找腎臟后下脂肪團(tuán)，提出卵巢，結(jié)扎輸卵管及血管。去卵巢組完整摘除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組取出卵巢周圍等量脂肪組織。最后羊腸線逐層縫合。云南白藥處理外傷，肌肉注射20萬U青霉素，防感染，連續(xù)5 d。術(shù)后8周，隨機(jī)選取10只麻醉，取右側(cè)股骨，雙能X線骨密度測量儀檢測造模情況。造模成功后，隨機(jī)分成6組：杜仲健骨方高中低劑量、阿侖膦酸鈉(陽性藥組)、模型組、假手術(shù)組。各組大鼠(除假手術(shù)組)灌胃給藥56 d，末次給藥后，股動脈采血。

2.2 骨密度檢測

將右側(cè)股骨剔除軟組織，雙能X線骨密度測定儀測定骨密度值，小動物BMD測試軟件分析。

2.3 血清ALP、TRAP、OC和PINP測定

大鼠經(jīng)腹腔麻醉，主動脈采血5 mL，室溫靜置1 h后， 3 000 r/min，離心10 min，收集上清液，分裝到EP管中，采用酶聯(lián)免疫測試方法(ELISA)檢測血清ALP、TRAP、OC和PINP含量。

2.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)

取右側(cè)股骨組織，按10～20 mg加入400 μL 裂解液 RL抽提骨組織總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定樣品吸光值(設(shè)定波長260和280 nm)，A260/280在1.8～2.0范圍內(nèi)符合要求，計(jì)算RNA質(zhì)量。引物序列設(shè)計(jì)，由哈爾濱維科生物科技有限公司合成(見表1)，取3 μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后PCR反應(yīng)檢測β-catenin mRNA、反應(yīng)條件：45 ℃ 30 min；90 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；50 ℃ 45 s，40個循環(huán)。

表1 引物及探針序列Table 1 Primer and probe sequences

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)法檢測骨組織Wnt3a、 β-catenin 蛋白表達(dá)

將左側(cè)股骨用液氮研磨至粉末狀，加入細(xì)胞裂解液，震蕩使組織充分裂解，4 000 r/min 離心10 min，得骨組織蛋白，經(jīng) BCA 法測定蛋白濃度。40 μg 蛋白上樣到 20%的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳(濃縮膠為 70 V，0.5 h；分離膠為 110 V，1 h)，分離的蛋白轉(zhuǎn)膜(80 V，30 min)，使用5%的脫脂奶粉封閉2 h 后，Wnt3a、β-catenin 抗體加入一抗4 ℃孵育過夜，次日1×TBST 洗3次，洗膜后孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體，室溫孵育 1 h，染色，膠片曝光，顯影，定影，軟件測定灰度值。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨密度的結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組骨密度顯著降低(P<0.01); 與模型組比較，杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組骨密度明顯增加(P<0.01或P<0.05)。通過表2結(jié)果可見，去除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型成功，陽性藥阿侖膦酸鈉治療效果最好，杜仲健骨方治療效果次之。

表2 各組大鼠骨密度值Table 2 Bone mineral density of rats in each group(n=10)

與假手術(shù)組比較：##P<0.05； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3.2 各組大鼠血清 ALP、TRAP、OC、PINP測定結(jié)果

見表3。與假手術(shù)組比較，模型組血清各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組大鼠血清中 ALP 、TRAP、PINP、OC含量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

3.4 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05，P<0.01)。 各給藥組與模型組比較Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05，P<0.01)。見表 4、圖1。

3.3 各組骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA的表達(dá)

結(jié)果見表5。與假手術(shù)組比較，模型組各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；杜仲健骨方高、中、低劑量組、陽性藥組的Wnt3a 、β-cateninm RNA表達(dá)水平與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

表3 各組大鼠ALP、TRAP、OC、PINP結(jié)果Table 3 Results of ALP,TRAP,OC and PINP in each group

與假手術(shù)組比較：##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表4 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)水平Table 5 Expression of Wnt3a and β-catenin protein in bone tissue

與假手術(shù)組比較：#P<0.05,，##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表5 骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA的表達(dá)水平Table 4 Expression of Wnt3a and β-catenin mRNA in bone tissue

與假手術(shù)組比較：##P<0.01； 與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

A.假手術(shù)組； B.模型組； C.杜仲健骨方低劑量； D.杜仲健骨方中劑量； E.杜仲健骨方高劑量； F.陽性藥組。

圖1 各組骨組織Wnt3a、β-catenin 蛋白的表達(dá)

Figure 1 Expression of Wnt3a andβ-catenin protein in bone tissue

4 討論

中醫(yī)學(xué)古典文獻(xiàn)里沒有“骨質(zhì)疏松癥”的記載，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者將其歸為“骨枯”、“骨痿”的范疇，腎虛是其根本病因[12]。大多群體為老年人及絕經(jīng)后婦女，癥狀為四肢酸軟、骨折、腰背疼痛等。臨床中常用雙膦酸鹽類、雌激素類、降鈣素類藥物，這些藥物治療效果一般[13-14]。因此，尋找安全有效低毒藥物成為迫切需求。本人根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，擬定的驗(yàn)方杜仲健骨方，符合中醫(yī)藥“補(bǔ)腎健骨”理論，臨床療效顯著，且不良反應(yīng)少。為闡明該方劑的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)考察大鼠血清ALP、TRAP、OC和I型原膠原N-端前肽(PINP)含量，檢測骨組織Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)情況，為中醫(yī)藥臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

骨密度(BMD)是診斷骨質(zhì)疏松癥公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 本實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠股骨骨密度，發(fā)現(xiàn)模型組與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.01)，說明復(fù)制骨質(zhì)疏松癥模型成功，給藥后骨密度值顯著提高。模型大鼠血清TRAP含量升高、ALP含量降低，表明骨代謝狀態(tài)異常。給藥后，杜仲健骨方中、低劑量組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，杜仲健骨方高劑量組與模型組比較有極顯著差異(P<0.01)，證實(shí)了該方劑能夠促進(jìn)骨形成。

Wnt是2個基因 Wg(wingless)和Int的合稱。Wnt 蛋白由19種蛋白組成，包括 Wnt1、Wnt3a、Wnt7b等[15]。最早發(fā)現(xiàn)于果蠅和脊椎動物體中。都參與胚胎、器官的發(fā)生，具有同源性。Wnt信號通路對細(xì)胞分化、增殖和凋亡過程具有調(diào)節(jié)作用，影響細(xì)胞生命進(jìn)程[16]。在阻斷劑和誘導(dǎo)劑的影響下，Wnt信號通路能夠影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化的能力，同時調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的平衡過程。Wnt信號通路在骨重建過程中起調(diào)節(jié)作用，是骨質(zhì)疏松重要病理基礎(chǔ)[17-19]。骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子為β-catenin，其表達(dá)水平和骨形成呈正相關(guān)。在Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin發(fā)揮了重要作用，其在胞質(zhì)中積累繼而向胞核的轉(zhuǎn)位，被認(rèn)為是該信號通路被激活的標(biāo)志[20]。β-catenin表達(dá)水平降低使血清ALP增加，骨密度降低導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杜仲健骨方各劑量組均能提高大鼠骨組織Wnt3a mRNA和蛋白表達(dá)水平。杜仲健骨方高、中劑量組均能提高大鼠骨組織β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平。杜仲健骨方劑量組與模型組比較Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)水平升高，說明該方劑是通過Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用，作用機(jī)制有待深入研究。