基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃芪治療重癥肌無力的機(jī)制研究

梁玉華,李亦聰,鄧太平,伍麗芳

(1.惠州市中心人民醫(yī)院，廣東 惠州 516001； 2.博羅縣中醫(yī)醫(yī)院，廣東 博羅 516000)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種乙酰膽堿受體(AChR)抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與、主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜AChR的獲得性自身免疫性的神經(jīng)肌肉疾病，表現(xiàn)為隨意肌力量的波動。該疾病的發(fā)病年齡、肌肉受累模式、嚴(yán)重程度和臨床病程具有高度異質(zhì)性[1-2]。其年均發(fā)病率為7.4/百萬人，患病率約為1/5 000[3]。西醫(yī)治療MG主要有膽堿酶抑制劑、激素、免疫抑制以及血漿置換等方法，但副作用大，費(fèi)用高，臨床應(yīng)用受到一定的限制[4]。目前中藥治療MG越來越受到重視，其可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痿證”“瞼廢”范疇。中醫(yī)痿證的致病機(jī)制包括先天不足、后天失養(yǎng)，或者由于外邪入體，或者由于情志刺激，或者由于疾病失治，或者由于病后失養(yǎng)，從而導(dǎo)致肌肉以及筋脈失養(yǎng)出現(xiàn)的疾病[5]，而基礎(chǔ)病機(jī)為脾腎虧虛，故升舉陽氣、補(bǔ)益脾腎是中醫(yī)治療重癥肌無力的主要治則。近年來，隨著循證醫(yī)學(xué)在中醫(yī)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，已有多篇中醫(yī)藥治療MG臨床療效的系統(tǒng)評價(jià)文獻(xiàn)發(fā)表，其結(jié)果表明，中醫(yī)藥在治療MG上有很好的療效和安全性。文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪注射液、黃芪復(fù)方顆粒、強(qiáng)肌健力方等皆以黃芪為主要組方藥材，在治療重癥肌無力(MG)方面療效甚佳[6]。黃芪，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[7]，為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicusBge. Hsiao的干燥根，歸脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效，用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、氣虛水腫等[8]。研究表明，黃芪具有明顯的抗疲勞、抗炎[9]、抗免疫[10]等作用，但其作用的分子機(jī)制不明確，因此借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘黃芪治療重癥肌無力的作用靶點(diǎn)和通路以闡明其作用機(jī)制具有一定的意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]這一概念最先由英國藥理學(xué)家Hopkins于2007年率先提出，是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科理論，從多維度闡述藥物干預(yù)疾病的分子機(jī)制。中藥因其成分復(fù)雜、系統(tǒng)龐大而不易研究，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥的作用機(jī)制符合中醫(yī)藥整體作用特點(diǎn)，因此為復(fù)雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的方法和視角[12]。Zhang等[13]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對烏頭湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。吳丹等[14]對柴胡抗抑郁作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測。劉志強(qiáng)等[15]從中藥有效成分和靶標(biāo)數(shù)據(jù)挖掘、反向分子對接技術(shù)與藥效團(tuán)匹配、相似性靶標(biāo)預(yù)測等方面對藥效成分進(jìn)行了篩選及對應(yīng)的靶標(biāo)預(yù)測，為中藥的深入研究提供了科學(xué)思路和重要參考。因此，本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選黃芪活性成分，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，探究黃芪治療重癥肌無力的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為黃芪治療重癥肌無力的臨床應(yīng)用提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪化學(xué)成分的收集和篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(hettp://lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)是基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)綜合分析藥效學(xué)、藥動學(xué)、靶標(biāo)預(yù)測以及網(wǎng)絡(luò)、組學(xué)和系統(tǒng)的平臺[16]。借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“黃芪”，得到活性成分的信息。本研究通過口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)，篩選出同時(shí)滿足OB>30%和DL>0.18的化學(xué)成分以及文獻(xiàn)報(bào)道的有活性的成分。

1.2 黃芪活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測與篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索出黃芪活性成分的作用靶點(diǎn)，作為候選藥物的作用靶點(diǎn)。然后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)將候選藥物靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成基因名稱。以“myasthenia gravis”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)搜索與MG相關(guān)的基因。將挖掘到的MG相關(guān)基因與藥物的靶點(diǎn)基因映射篩選得出共同基因，從而得到黃芪活性成分治療MG的相關(guān)作用靶標(biāo)。

1.3 活性成分-重癥肌無力作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪活性成分與治療重癥肌無力作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果，去除無對應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。利用Cytoscape3.7.1將數(shù)據(jù)導(dǎo)入，建立黃芪活性成分-疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)是基因、蛋白或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接(edge)代表中藥成分與其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將黃芪的作用蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入 String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，以構(gòu)建黃芪治療MG靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)[17]。限定物種為“homo sapiens”(人類)，設(shè)定最低相互作用閾值為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持不變，得到蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果保存為TSV格式。保留文件中node1、node2和Combined score信息并導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，保存網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，并將節(jié)點(diǎn)(node)大小設(shè)置用于反映度值(degree)的大小，邊(edge)的粗細(xì)設(shè)置用于反映combined score的大小，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能分析與KEGG通路富集分析

基因本體論(gene ontology，GO)是用于描述基因產(chǎn)物功能并且廣泛應(yīng)用于生物信息學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)本體[18]。DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp，Version 6.8)是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，從中提取生物信息[19]。將黃芪-MG交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因列表，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶點(diǎn)基因修正為官方名稱(“official gene symbol”)，設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行GO生物過程富集分析和KEGG 通路富集分析，結(jié)果用R語言作圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分及靶點(diǎn)的篩選

TCMSP中以O(shè)B>30%,DL>0.18為篩選條件獲得20個(gè)黃芪活性成分，結(jié)果見表1。逐一對應(yīng)靶點(diǎn)，得到黃芪活性成分靶點(diǎn)462個(gè)。

2.2 疾病(MG)作用靶點(diǎn)獲取結(jié)果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到581個(gè)MG相關(guān)靶點(diǎn)基因。

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)與重癥肌無力相關(guān)作用靶點(diǎn)取交集得到活性成分-疾病靶點(diǎn)基因12個(gè)，對應(yīng)黃芪20個(gè)活性成分。利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將取交集得到的12個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨trings數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2示。PPI網(wǎng)絡(luò)包括了12個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)，共有57條邊代表了蛋白之間的相互作用，處于該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中心的蛋白質(zhì)有ESR1、IL-6、MYC、VEGFA、CRP、ESR2等，可能是黃芪治療重癥肌無力的重要靶點(diǎn)。

2.5 GO功能分析

12個(gè)藥物活性成分-疾病交集基因影響了22個(gè)生物學(xué)過程(P<0.05)，選取排名前20的功能信息，見表2，圖3。結(jié)果顯示，黃芪的活性成分主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，核受體活性，轉(zhuǎn)錄因子活性，銨離子結(jié)合，類固醇受體激素結(jié)合，受體調(diào)節(jié)活性，生長因子受體結(jié)合，血小板源性生長因子受體結(jié)合，乙酰膽堿受體活性等方面。

表1 黃芪中代表成分信息

Table 1 Chemical information of main compounds inAstragaliRadix

Mol IDMolecule NameOB/%DLMOL000211Mairin(白樺脂酸)55.380.78MOL000239Jaranol(華良姜素)50.830.29MOL000296Hederagenin(常春藤皂苷元)36.910.75MOL000033C136.230.78MOL000354Isorhamnetin(異鼠李素)49.600.31MOL0003713,9-di-O-methylnissolin53.740.48MOL000374C241.720.69MOL0003787-O-methylisomucronulatol74.690.30MOL000379C336.740.92MOL000380C464.260.42MOL000387Bifendate(聯(lián)苯雙酯)31.100.67MOL000392Formononetin(刺芒柄花素)69.670.21MOL000398Isoflavanone(異黃烷酮)109.990.30MOL000417Calycosin(毛蕊異黃酮)47.750.24MOL000422Kaempferol(山奈酚)41.880.24MOL000433FA68.960.71MOL000438C567.670.26MOL000439isomucronulatol-7,2'-di-O-glucosi-ole49.280.62MOL000442C639.050.48MOL000098Quercetin(槲皮素)46.430.28

C1. (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol;C2.5′-hydroxyiso-muronulatol-2′,5′-di-O-glucoside; C3. 9,10-dimethoxy-pterocarpan-3-O-β-D-glucoside; C4. (6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol; C5. (3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol; C6. 1,7-Dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene。

注:橢圓為活性成分-疾病交集基因,三角形為藥物有效成分圖1 藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Active drug ingredient-target network diagram

圖2 黃芪治療MG靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network diagram of Astragali Radix in treat-ment of MG target protein

表2 藥物-疾病交集基因具有的功能信息Table 2 Functional information of drug-disease intersection genes

圖3 GO 功能富集分析柱狀圖
Figure 3 Histogram of GO function enrichment analysis

2.6 黃芪發(fā)揮治療重癥肌無力作用靶點(diǎn)的通路富集分析

使用DAVID平臺進(jìn)行KEGG通路富集分析，以分析12個(gè)黃芪活性成分-重癥肌無力作用靶基因在信號通路的作用。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)靶點(diǎn)顯著富集在29條通路上(P<0.05)，其中20條通路與MG密切相關(guān)(見圖4)。其中包含了PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、膽堿能突觸通路、乙肝通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、EB病毒感染通路、HIF-1信號通路、大腸癌通路、雌激素信號通路、JAK-STAT信號通路等，提示黃芪可以通過調(diào)控以上通路參與MG的治療。相關(guān)通路圖見圖5。

注：圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；P值越小，圓點(diǎn)顏色越紅。

圖4 黃芪治療MG關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的通路富集信息氣泡圖
Figure 4 Pathway enrichment information bubble map ofAstragaliRadixtreatment of MG key targets

圖5 黃芪治療MG的相關(guān)通路
Figure 5AstragaliRadixtreatment of MG related pathway

3 討論

黃芪性溫，微甘，補(bǔ)脾益氣，能入脾而主肌肉，其成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，對機(jī)體免疫起到雙向調(diào)節(jié)作用。以其作為主要藥物的復(fù)方在MG治療中占很大的比例[20]，而臨床上常應(yīng)用大劑量黃芪治療MG療效顯著[21]，因此，研究黃芪治療MG具有重要的意義。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫與軟件對黃芪治療MG的作用機(jī)制進(jìn)行探討。本次研究收集到與黃芪治療重癥肌無力的相關(guān)活性成分有異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、山奈酚(kaempferol)、毛蕊異黃酮(calycosin)、異黃烷酮(isoflavanone)、槲皮素(quercetin)等。有研究顯示，異鼠李素是黃芪常見的黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)的作用，能抑制細(xì)胞炎癥因子IL-6的釋放[22]。根據(jù)活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示，黃芪治療重癥肌無力具多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明黃芪的靶基因之間是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮著相互作用。研究結(jié)果表明，黃芪的10種活性成分與MG相關(guān)，其中槲皮素、山奈酚、刺芒柄花素連接較多靶點(diǎn)數(shù)。ESR1、IL-6、MYC、VEGFA等靶基因度值較大，是黃芪治療MG的重要靶點(diǎn)，預(yù)測其在黃芪治療重癥肌無力中發(fā)揮重要的作用。其中，研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能敲出小鼠對EAMG產(chǎn)生抵抗[23]，可促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)IL-2R和IL-2而致病，在MG發(fā)病中發(fā)揮重要作用,因此預(yù)測黃芪可能作用于IL-6靶點(diǎn)而發(fā)揮治療作用。

本研究顯示，黃芪與重癥肌無力(MG)的交集基因有12個(gè)，進(jìn)一步提煉黃芪治療MG的生物學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)其涉及神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、銨離子結(jié)合、類固醇受體激素結(jié)合、受體調(diào)節(jié)活性、生長因子受體結(jié)合、血小板源性生長因子受體結(jié)合等生物過程，這與MG的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。另外，通過David數(shù)據(jù)庫對12個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，得到P<0.05的信號通路，由KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)20條信號通路與MG發(fā)病顯著相關(guān)，包括PI3K-Akt信號通路、AGE-RAGE信號通路、膽堿能突觸通路、EB病毒感染通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路、MicroRNA信號通路、人類Ⅰ型T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)信號通路等。

近年來隨著臨床和基礎(chǔ)的深入研究發(fā)現(xiàn)，MG的發(fā)生與病毒的持續(xù)感染、遺傳因素和免疫應(yīng)答異常密切相關(guān)。在病因方面，認(rèn)為通過外因如EB病毒感染影響內(nèi)因起到相關(guān)作用[24]。多項(xiàng)研究表明，EB病毒感染可能與MG的發(fā)生有一定的相關(guān)性。Cavalcante等發(fā)現(xiàn)MG患者的胸腺中存在活動的EB病毒感染，其激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BZLF1呈高表達(dá)狀態(tài)[25]，還進(jìn)一步證實(shí)了EB病毒在MG患者的胸腺中持續(xù)的感染和胸腺自身的免疫反應(yīng)相關(guān)。因此黃芪可能是通過調(diào)控EB病毒感染信號通路，阻止其參與免疫疾病的發(fā)生，從而起到治療MG的作用。另有研究顯示，人類Ⅰ型T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)病毒感染也與MG發(fā)病相關(guān)，而黃芪同時(shí)也能通過調(diào)控人類Ⅰ型T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)信號通路而發(fā)揮作用。同時(shí)有研究表明[26]，miRNA可能通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)相關(guān)補(bǔ)體、乙酰膽堿受體(ACHR)抗體和酪氨酸激酶(MUSK)抗體等致病抗體的分泌，參與MG的發(fā)病。預(yù)測黃芪的活性成分可能通過調(diào)控miRNA信號通路來調(diào)節(jié)抗體的分泌，從而發(fā)揮治療MG的作用。

綜上所述，本研究通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對黃芪治療MG進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以探討黃芪治療MG的潛在作用機(jī)制，并得出了黃芪可能參與治療重癥肌無力作用的靶點(diǎn)與相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)黃芪通過多種活性成分作用于多靶點(diǎn)參與MG發(fā)病，為臨床應(yīng)用黃芪治療重癥肌無力提供了新的方向。