甘草飲片與甘草配方顆粒在四逆湯中減毒作用比較

曾歡，何翠敏，蘇慧琳，薛壯壯，伍曉陽，吳淼清，王文娟，王穎芳，2

(1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006 ； 2.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

中醫(yī)臨床傳統用藥以湯劑為主要劑型，以辨證施治、隨癥加減的特點著稱。隨著中藥現代化發(fā)展和劑型改革，單味中藥配方顆粒應運而生，其服用方便、運輸攜帶便捷、劑量準確等諸多優(yōu)點因適應了現代快節(jié)奏的生活，受到了醫(yī)護人員及患者的廣泛歡迎[1-3]。

四逆湯為張仲景所創(chuàng)名方，由附子、干姜、炙甘草組成。其中附子為君藥，味辛，性大熱，起回陽救逆之功效。但附子自古就被記載有大毒，即便是炮制品也需嚴格限制用量。方中配伍甘草以減輕附子毒性并緩和其峻烈之性?，F代研究表明，附子的主要毒性成分也是藥效成分，主要是雙酯型二萜類生物堿，包括烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿。附子的主要毒性靶器官為心臟，次烏頭堿可對心肌細胞產生毒性，使心肌細胞缺血缺氧而受損[4]。有學者對四逆湯組方的配伍減毒效果進行實驗研究[5]，發(fā)現四逆湯全方以及附子配伍甘草或干姜的混煎液中，各類烏頭堿的含量均有不同程度的降低。說明四逆湯中的配伍藥物在煎煮的過程中對附子的有毒成分產生了影響進而降低了整個處方的毒性和毒副作用。

由此推測，現代流行的由各單味中藥配方顆粒以熱水混合攪拌而成的配方顆粒劑的應用，缺少類似傳統湯劑中高溫共煎這一過程，在四逆湯傳統湯劑和四逆湯配方顆粒劑中，甘草減低附子毒性的程度是否存在差異，有待實驗研究探討。

由于只是為了檢測附子毒性的大小差異，所以本次實驗采用了正常小鼠進行研究而沒有選擇任何動物模型；以附子毒性的主要靶器官心臟的心肌缺血受損程度為毒性大小的參考指標，比較兩種劑型、兩種用藥方式的四逆湯中甘草減低附子毒性程度的差異，為臨床上四逆湯的兩種用藥方式選擇提供參考。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性昆明小鼠，體質量(20±2)g，購于中山大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2017-0125。

1.2 材料與試劑

飲片：生附片、干姜、炙甘草均購自廣州百和堂藥業(yè)有限公司，分別為毛茛科植物烏頭AconitumcaimichaeliiDobx.子根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖的炮制品、姜科植物姜Zingiberofficinale(Willd.) Rosc.的干燥根莖。顆粒：淡附片(批號：6101471；規(guī)格：每袋裝0.7 g相當于飲片6 g)、干姜(批號：7031802；規(guī)格：每袋裝0.5 g相當于飲片3 g)、炙甘草(批號：7020082；規(guī)格：每袋裝0.5 g相當于飲片3 g)，均購自廣東一方制藥有限公司。谷草轉氨酶(AST)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171030001)、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20171030020)。

1.3 主要儀器

酶標儀(MTP-601F，Tecan Genio公司);肛溫計(BL-T990，深圳市貝利斯科技發(fā)展有限公司);超低溫離心機(3-30K型，德國Sigma公司)。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 傳統湯劑組 分別取生附片15 g、炙干草飲片15 g和干姜飲片10 g，上述3味藥置于圓底燒瓶中，加10倍量的水浸泡0.5 h后，加熱回流提取，武火煮沸后文火保持微沸30 min；第2次加8倍量的水提取20 min，合并2次水提液，趁熱用紗布濾過，減壓濃縮至適量，加水定容至質量濃度為0.5 g/mL[6]。

2.1.2 去甘草傳統湯劑組 分別取生附片24 g和干姜飲片16 g，余同“2.1.1”。

2.1.3 配方顆粒劑組 按傳統組各單味藥比例組方，用80 ℃熱水溶解，加水定容至質量濃度為0.5 g/mL。

2.1.4 去甘草配方顆粒劑組 按去甘草傳統組各單味藥比例組方，余同“2.1.3”。

2.1.5 空白對照組 0.9%的NaCl溶液。

2.2 動物分組與給藥

40只小鼠隨機分為傳統湯劑組、去甘草傳統湯劑組、配方顆粒劑組、去甘草配方顆粒劑組、空白對照組，每組8只。按每日劑量為0.2 mL/10 g灌胃，每天1次，連續(xù)7 d，灌胃前12小時禁食不禁水。每天灌胃前測量體質量，分別測量第1、4、7天的灌胃前和灌胃3 h后的肛溫。觀察各組小鼠的行為活動，如活動狀態(tài)、毛發(fā)光澤、進食飲水情況、排泄狀況并做記錄。

2.3 生化指標的檢測

第8天眼球取血，靜置，待血液凝固后，離心(3 000 r/min，15 min)，取上清液，用相應的試劑盒檢測各組LDH和AST水平。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 不同四逆湯組小鼠行為活動變化比較

以空白對照組為參照，各實驗組小鼠活動均減少，較安靜，普遍出現扎堆、靜臥現象，飲食量和進水量較對照組少。傳統湯劑組小鼠糞便顏色較黑且干；去甘草傳統湯劑組小鼠糞便顏色呈淺黑色；配方顆粒劑組小鼠糞便由黃色轉變?yōu)樽攸S色，再轉變到黑色；去甘草配方顆粒劑組小鼠糞便顏色由淺黃色轉變?yōu)闇\黑色。

3.2 不同四逆湯組對小鼠體質量的影響

給藥7 d后，與空白組小鼠體質量比較，去甘草傳統湯劑組、去甘草配方顆粒劑組小鼠體質量明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 不同四逆湯組對小鼠體質量的影響

組別第1天第7天空白對照組18.00±1.0719.50±1.41傳統湯劑組18.75±1.4920.75±1.49去甘草傳統湯劑組18.25±0.7121.00±1.07*配方顆粒劑組18.00±1.0720.57±1.51去甘草配方顆粒劑組18.00±1.5121.00±1.07*

與空白對照組比較：*P<0.05。

3.3 不同四逆湯組對小鼠灌胃前后肛溫的影響

第1、4、7天灌胃前和灌胃3 h后，各組小鼠前后肛溫相關性較差，前后數據差異無統計學意義，只有去甘草傳統湯劑組第7天灌胃前后的肛溫值相關性較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3.4 不同四逆湯組對小鼠血清AST與LDH的影響

配方顆粒劑組的AST水平顯著高于空白對照組和去甘草傳統湯劑組(P<0.05)，LDH水平也明顯高于其他各組(P<0.01)。此外，傳統湯劑組LDH水平與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 不同四逆湯組對小鼠灌胃前后肛溫的影響

組別第1天灌胃前第1天灌胃后第4天灌胃前第4天灌胃后第7天灌胃前第7天灌胃后空白對照組36.95±0.3535.81±0.7736.14±0.7536.87±0.7935.45±0.2936.82±0.73傳統湯劑組37.45±0.5534.34±0.5236.76±0.3535.76±0.4635.59±0.5635.95±0.81去甘草傳統湯劑組36.85±0.8533.57±0.8836.95±0.4536.64±0.7935.81±0.35*36.44±0.66配方顆粒劑組37.10±0.2834.07±1.0336.74±0.4536.99±0.6735.53±0.6736.01±0.57去甘草配方顆粒劑組37.01±0.6033.60±0.9536.05±0.3836.39±0.8635.19±0.3735.99±0.71

與去甘草傳統湯劑組第7天灌胃后肛溫比較：*P<0.05。

表3 不同四逆湯組對小鼠血清AST與LDH的影響

與配方顆粒劑組比較：△P<0.05，**P<0.01；與空白對照組比較：#P<0.05。

4 討論

四逆湯全方由附子、干姜、炙甘草三味藥組成。附子為君藥，干姜為臣，炙甘草為佐使。附子可強心、升壓，起回陽救逆之功效，是四逆湯發(fā)揮功效的主藥；干姜性溫，促進胃腸道血液循環(huán)，提高烏頭堿在胃腸道的吸收程度[7]，與附子配伍相須為用、協同增效；炙甘草性緩，配伍附子既緩和其峻烈之性又起減毒作用[8]。甘草中的甘草黃酮能拮抗烏頭堿引發(fā)的心律失常[9]；甘草甜素具有腎上腺皮質激素樣作用，能增強肝臟的減毒功能[10]；此外，甘草次酸也可能在煎煮過程中與堿性生物堿中和形成沉淀以降低水煎液中烏頭堿的含量來發(fā)揮降低附子毒性的功能[5]?？梢?，四逆湯這一經典名方的配伍從現代藥理來分析，既有協同增效的效果，又有相互制約、抑制減毒的效果。

為了比較甘草飲片和甘草配方顆粒在四逆湯中對附子毒性的降低效果差異，課題組以組方中附子毒性大小為探究目標，設計了本實驗。據有關研究報道[11]，附子在超過藥效劑量9 g開始，出現對心肌細胞的損傷作用。根據中國藥典中四逆湯的劑量[12]，以生藥量計算，成人1天的最高服用劑量為48 g/60 kg，折合小鼠用藥劑量為0.1 456 g/20 g。為了放大附子在組方中的毒性，實驗中課題組以較高的給藥量(0.2 g/20 g)灌胃正常小鼠，測定AST和LDH值以評價不同四逆湯對正常小鼠心肌細胞的損傷程度，以此比較甘草飲片和甘草配方顆粒在四逆湯中對附子減毒效果的異同。

根據實驗結果，各實驗組小鼠活動均減少，普遍出現扎堆、靜臥現象；灌胃7 d后，兩拆方組小鼠體質量比空白對照組有較顯著的增加(P<0.05)；第7天只有去甘草傳統湯劑組灌胃后的肛溫較灌胃前有較顯著升高(P<0.05)，表明高劑量四逆湯傳統湯劑中附子對正常小鼠產生的毒副作用對肛溫有一定的影響，可能與去掉甘草以后整方的溫燥效果增強有關，側面說明了甘草的減毒作用配伍的必要性。心肌酶的釋放量是心肌損害的主要標志，一定程度上反映心肌病變程度；AST主要分布在心肌上，心肌細胞受損時，細胞膜被破壞，大量酶釋放入血，血清中AST含量明顯升高。LDH作為胞質中的酶，只有在細胞受損時才可能大量溢出胞外，LDH增加反映細胞膜損傷的同時，也是心肌缺血的早期診斷指標[13-15]。本研究結果實驗組AST、LDH活性均升高，配方顆粒劑組小鼠的AST顯著高于空白對照組和去甘草傳統湯劑組(P<0.05)，LDH值則極顯著高于其他各組(P<0.01)。表明在高劑量的四逆湯給藥情況下，四逆湯配方顆粒劑對心肌細胞造成的缺血損傷要強于傳統湯劑。提示傳統湯劑的用藥方式可能更利于降低附子的毒性，值得進一步研究。拆方組的AST和LDH水平反而低于全方組，可能是干姜配伍附子很大程度上也降低了附子中的烏頭類生物堿含量[16]，抑制附子中毒性較大的雙酯型生物堿的吸收,使其在小腸中的生物利用度明顯降低[11]。是否為臨床上“附子無姜不熱”提供理論依據，有待進一步探討。后續(xù)研究在本次實驗的基礎上，可以考慮增加心電圖測定、病理組織學觀察等更全面地評價附子的心臟毒性和心肌細胞損傷程度。也可增加急性毒性實驗和長期毒性實驗，以更客觀比較兩種用藥方式附子毒性大小的差異。

比較傳統飲片和配方顆粒用藥方式的效果異同，楊春燕等[17]以附子理中湯為研究對象，用高效液相法檢測烏頭堿類含量，結果附子理中湯超微顆粒中烏頭類生物堿成分的含量顯著高于其傳統飲片，超微飲片中的烏頭堿成分和新烏頭堿成分的含量分別是其傳統飲片的3.77倍和15.72倍。進一步比較附子是否煎煮的用藥效果異同，羅恒等[18]利用高效液相色譜(HPLC)結合電噴霧電離(ESI)串聯質譜方法，研究附子烏頭堿煎制過程中附子烏頭生物堿的動態(tài)變化模式，結果表明煎煮可以明顯促進雙酯型二萜類生物堿轉化為毒性較低的烏頭原堿類生物堿從而降低臨床毒性。梁碧彥[19]等以240例寒濕痹阻證患者為研究對象,通過先煎時間、煎煮總時間的不同,對比研究影響臨床應用附子出現不良反應的相關因素,結果表明附子煎煮總時間越長,不良反應發(fā)生率越低。提示高溫煎煮確是降低附子毒性的有效方法。提示課題組的實驗結果中，四逆湯傳統湯劑組的毒性明顯低于配方顆粒組的原因，可能與傳統湯劑的用藥過程中附子經過了煎煮從而毒性降低有關。

自從中藥配方顆粒逐漸被廣泛應用以來，關于中藥配方顆粒和傳統湯劑藥效毒理研究結果表明：74.5%的隨機對照組顯示配方顆粒療效與湯劑相似，11.8%的隨機對照組顯示配方顆粒療效優(yōu)于傳統湯劑[20]。課題組和上述部分研究者的結果表明，就四逆湯中附子毒性的降低程度來說，傳統湯劑的煎煮用法優(yōu)于配方顆粒的免煎用法?？梢?，中藥諸多成分在煎煮過程中，發(fā)生了復雜的化學反應和物理反應；現代工藝利用各種提取方法高效提取了中藥材中的有效成分，因此，中藥傳統湯劑和配方顆粒劑孰優(yōu)孰劣不可一概而論，臨床用藥需要權衡便捷、藥效和安全性進行選擇。