梨果實(shí)細(xì)胞分裂期內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

蒲小秋，田 嘉，李 疆，張 艷，李 鵬，覃偉銘，井春芝

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州沙依東園藝場(chǎng)，新疆 庫(kù)爾勒 841000；3.新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣中心，新疆 庫(kù)爾勒 841000）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（quantitative real-time PCR technology，qRT-PCR technology）是開(kāi)展基因表達(dá)分析的關(guān)鍵技術(shù)，以循環(huán)放大材料中本底基因表達(dá)量與熒光檢測(cè)相結(jié)合的方法定量分析基因表達(dá)量，具有高效、靈敏、穩(wěn)定和成本低等特點(diǎn)[1]。qRT-PCR技術(shù)分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量分析兩種，相對(duì)定量分析比絕對(duì)定量分析的應(yīng)用更加簡(jiǎn)單和普遍，其通過(guò)檢測(cè)樣品中目標(biāo)序列和另一參照序列的表達(dá)量，通過(guò)對(duì)比兩種表達(dá)量對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。相對(duì)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性常受RNA樣品質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率、PCR效率差異、上樣量及上樣過(guò)程等因素的干擾，因此，需選擇較為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行誤差校正及標(biāo)準(zhǔn)化處理，理想的內(nèi)參基因在植物的不同組織中和不同發(fā)育時(shí)期及不同處理中都應(yīng)能穩(wěn)定表達(dá)，不存在假基因且其表達(dá)量與目的基因表達(dá)量相近[2-3]。目前，植物中常用的內(nèi)參基因有甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因（GAPDH）、肌動(dòng)蛋白基因（Actin）、微管蛋白基因（TUB）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1α）和泛素連接酶基因（UBQ）等[4]。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，任何一個(gè)內(nèi)參基因都不能適用于所有條件下的實(shí)驗(yàn)研究。如GAPDH在核桃不同基因型、不同組織中、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)均穩(wěn)定，但在蘋(píng)果不同基因型中表達(dá)的穩(wěn)定性差[5-6]；UBQ在鹽脅迫下玉蘭不同組織器官中的表達(dá)穩(wěn)定，但在黃梁木不同組織中表達(dá)的穩(wěn)定性差[7-8]。因此，在利用qRT-PCR進(jìn)行定量分析之前，有必要驗(yàn)證、篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以減小供試樣本間的差異性，以期獲得更加準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

梨屬于薔薇科Rosaceae梨亞科Poaceae梨屬Pyrus L.植物，在我國(guó)的分布廣泛，其種質(zhì)資源豐富。梨果實(shí)可鮮食、制干、榨汁、釀酒、入藥等，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。梨果實(shí)的生長(zhǎng)時(shí)期可分為細(xì)胞分裂期和細(xì)胞膨大期兩個(gè)主要時(shí)期，其在生長(zhǎng)開(kāi)始，以細(xì)胞分裂為主，在授粉50 d左右時(shí)以細(xì)胞膨大為主，梨為假果，果肉部分由花托發(fā)育形成，花期花托細(xì)胞分裂和幼果期果肉細(xì)胞分裂共同組成了梨果實(shí)細(xì)胞分裂期[9-10]。果實(shí)的細(xì)胞分裂期是對(duì)果實(shí)品質(zhì)具有重要影響的時(shí)期。前人研究發(fā)現(xiàn)，某些基因在果實(shí)細(xì)胞分裂期大量表達(dá)，因此，果實(shí)細(xì)胞分裂期是果實(shí)品質(zhì)調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)期。如TIAN等人[11]發(fā)現(xiàn)，在梨幼果期，F(xiàn)WL1基因表達(dá)與果實(shí)大小呈反比關(guān)系，說(shuō)明這一基因與梨果實(shí)大小發(fā)育密切相關(guān)；岳海林[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃花梨中鈣調(diào)素（CuCaM）在盛花期子房幼果中的大量表達(dá)，可能與果實(shí)中鈣的增加有一定的關(guān)系。因此，篩選出梨果實(shí)細(xì)胞分裂期內(nèi)合適的內(nèi)參基因，不僅可以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，還能省時(shí)省力。目前，未見(jiàn)到有關(guān)梨果實(shí)細(xì)胞分裂期內(nèi)參基因的篩選報(bào)道，已報(bào)道的梨中常用的內(nèi)參基因分別有Actin1[13]、Actin2[14]、TUB1[15]和TUB2[16]等。本研究在對(duì)梨果實(shí)細(xì)胞分裂期的內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR篩選 時(shí)，選用了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH這8個(gè)候選基因，這些基因均為傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，是生物體生命活動(dòng)中不可或缺的。EF1α主要參與快速增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖[17]，UBI參與細(xì)胞中的代謝過(guò)程[4]，Actin對(duì)細(xì)胞分裂、細(xì)胞基本骨架結(jié)構(gòu)的維持及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)都可起到重要作用[18]，TUB控制表達(dá)生物體維持生命活動(dòng)所必需的細(xì)胞器骨架的基本組分蛋白基因[19]，GAPDH與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[20]。目前，研究?jī)?nèi)參基因的常用手段分別有轉(zhuǎn)錄組分 析[21]、同源基因克隆[22]及常見(jiàn)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析[23]等。梨FWL1是fw2.2的同源基因，其在細(xì)胞分裂期的作用，主要負(fù)責(zé)調(diào)控果實(shí)的大小，其功能已在番茄、玉米、櫻桃、梨等物種中被預(yù)測(cè)和鑒定[24]。本研究選用上述的8個(gè)常見(jiàn)內(nèi)參基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，分別以杜梨（小果型，常用來(lái)做砧木）[25]、香梨（中果型）和鴨梨（大果型）果實(shí)細(xì)胞分裂期的幼果果肉為試材，利用geNorm[26]和NormFinder[27]統(tǒng)計(jì)軟件比較分析了各候選內(nèi)參基因在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期的表達(dá)穩(wěn)定性，旨在篩選出梨果實(shí)細(xì)胞分裂期合適的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取來(lái)源于新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州沙依東園藝場(chǎng)中樹(shù)齡為25 a、樹(shù)勢(shì)中庸、樹(shù)體健康、栽培管理?xiàng)l件一致的杜梨、香梨和鴨梨作為供試材料，分別采集梨花露紅期（對(duì)枝條進(jìn)行套袋處理）、盛花期（對(duì)前期套袋處理的枝條進(jìn)行統(tǒng)一授粉并掛牌標(biāo)記，授粉品種為碭山酥梨）的花朵，去除子房以上的所有部位（包含柱頭、雄蕊、花瓣），去除花柄；分別采集授粉后10、20、30、40 d的幼果果肉進(jìn)行研究。每個(gè)時(shí)期采集30個(gè)混合樣本，重復(fù)3次，采后立即以液氮速凍，置于-80 ℃的超低溫冰箱中凍存以備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEND，北京）進(jìn)行總RNA的提取，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸分析儀檢測(cè)總RNA的完整性、濃度和純度；以A260/A280之值為1.8～2.1且凝膠電泳條帶清晰的RNA為模板，按照FastKing RT Kit（With gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEND，北京）中說(shuō)明書(shū)的操作方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成的cDNA置于-20 ℃的溫度條件下保存以備用。

1.2.2 內(nèi)參基因的選擇

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[23,28-29]中報(bào)道過(guò)的候選內(nèi)參基因，選擇了TUB1、TUB2、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH這8個(gè)候選基因作為梨不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因。所用引物來(lái)源于已報(bào)道的文獻(xiàn)中，F(xiàn)WL1來(lái)源于TIAN等人[11]的研究結(jié)果，所有引物均由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物的基本情況見(jiàn)表1。

表1 用于RT-PCR及熒光定量PCR的引物Table 1 Primers for RT-PCR and qPCR

1.2.3 內(nèi)參基因的普通PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，對(duì)8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的特異性。反應(yīng)體系為25 μL，包括10×EasyTaq?Butter 2.5 μL，2.5 mM的dNTPS 2 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L的 上、下游引物各0.5 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 0.3 μL，ddH2O 18.2 μL。反應(yīng)程序設(shè)置：94 ℃，3 min預(yù)變性；94 ℃，10 sec變性；57 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共35個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃，5 min延伸；用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 內(nèi)參基因的qPCR擴(kuò)增

使用BIO-RAD CFX Connect? 熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各內(nèi)參基因的表達(dá)情況，使用試劑為Power SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems?Cat：4367659）。使用的PCR程序?yàn)椋?5 ℃，3 min預(yù)變性；95 ℃，10 sec變性；55 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共40個(gè)循環(huán)；之后于65～95 ℃的溫度條件下進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，每個(gè)樣品均重復(fù)3次，根據(jù)生成的溶解曲線(xiàn)判斷8個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增特異性；并根據(jù)獲得的8個(gè)基因的循環(huán)閾值（Ct值）分析各個(gè)候選內(nèi)參基因在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期的表達(dá)情況。

1.2.5 引物擴(kuò)增效率的計(jì)算

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA產(chǎn)物濃度，將不同樣品分別稀釋至500 ng/mL，每個(gè)樣品取100 μL 并分別稀釋成5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度稀釋5倍，最終獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)模板濃度即分別為500.0、100.0、20.0、4.0、0.8 ng/mL，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。用BIO-RAD CFX Connect? System進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，獲得Ct值；再利用Excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可獲得相關(guān)系數(shù)(R2)和擴(kuò)增效率(E)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel整理RT-qPCR檢測(cè)得到的Ct值，先利用geNorm和NormFinder軟件對(duì)8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；以FWL1為目的基因?qū)Ψ€(wěn)定性不同的4個(gè)候選基因（TUB2、Actin1、Actin2和TUB1）進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果分析

2.1 RNA的提取

以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，28S、18S條帶清晰，以蛋白核酸分析儀檢測(cè)到的A260/A280之值為1.8～2.1，說(shuō)明提取的RNA中沒(méi)有蛋白質(zhì)等物的污染，其完整性良好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 梨總RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoretic detection result of total RNA extracted from pear

2.2 候選內(nèi)參基因引物質(zhì)量的檢測(cè)

對(duì)選取的8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，所用Mark為2 000 bp DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物如圖2所示，其大小與理論大小一致，無(wú)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其條帶整齊，無(wú)引物二聚體。對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析，結(jié)果顯示，所有引物均有良好的擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)，熔解曲線(xiàn)的熔解峰值單一（圖3），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，可得出qPCR引物的擴(kuò)增效率為99.89%～111.29%，其相關(guān)系數(shù)R2值均≥0.99，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好（表2）。上述結(jié)果表明，8個(gè)候選內(nèi)參基因的引物均符合qRT-PCR引物要求，均可用于梨果實(shí)細(xì)胞分裂期內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

2.3 內(nèi)參基因的Ct值分析

在RT-qPCR分析中，內(nèi)參基因的Ct值反映了基因的表達(dá)量，Ct值越小，說(shuō)明基因表達(dá)量越高，而Ct值越大，基因表達(dá)量則越低。不同梨組織中8個(gè)候選內(nèi)參基因的平均Ct值如圖4所示。從圖4中Ct值的分布情況可以看出，TUB1的平均Ct值最小，為18.14，說(shuō)明其在不同組織樣品中的轉(zhuǎn)錄水平最高；UBI的平均Ct值僅次于TUB1，為19.61；而TUB3的轉(zhuǎn)錄水平最低，其平均Ct值最大，為25.99；其他各候選內(nèi)參基因的平均Ct值均為20～26。這一結(jié)果表明，在qRT-PCR分析中，8個(gè)候選內(nèi)參基因存在差異，因此，對(duì)8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行比較分析是十分必要的。

圖2 8個(gè)候選內(nèi)參基因引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of eight candidate reference genes

圖3 各內(nèi)參基因的溶解曲線(xiàn)Fig.3 Melting curves of internal reference genes

表2 8種引物的相關(guān)系數(shù)與擴(kuò)增效率Table 2 Correlation coefficients and amplification efficiencies of eight primers

2.4 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.4.1 以geNorm軟件分析

geNorm軟件分析是通過(guò)將Ct值的平均值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后導(dǎo)入軟件中，以基因配對(duì)的形式不斷去除最不穩(wěn)定的基因，最后比較基因表達(dá)穩(wěn)定值（M）的大小來(lái)進(jìn)行候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序的，其中M值越小，基因的表達(dá)穩(wěn)定性則越強(qiáng)。以geNorm軟件分析得出的8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M）見(jiàn)表3。從表3中可以看出，在總樣本和花期樣本中，各個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次為T(mén)UB2/Actin1、Actin2、GAPDH、EF1a、UBI、TUB3、TUB1，說(shuō)明在總樣本和花期樣本中TUB2和Actin1是最合適的內(nèi)參基因；在果期樣本中，各個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次為T(mén)UB2/UBI、Actin2、GAPDH、EF1a、Actin1、TUB3、TUB1，說(shuō)明在果期樣本中TUB2和UBI是最合適的內(nèi)參基因。對(duì)內(nèi)參基因的配對(duì)差異值的分析結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在所有樣本中，因Vn/(n+1)（表示配對(duì)差異值，式中的n表示內(nèi)參基因數(shù)量）均大于閾值0.15，所以無(wú)法確定最合適的內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)。

圖4 不同梨組織中8個(gè)候選內(nèi)參基因的平均Ct值Fig.4 Mean Ct values of eight candidate internal reference genes of different pear tissues

圖5 以geNorm軟件分析得出的內(nèi)參基因的配對(duì)差異值Fig.5 Obtained pairwise difference values of internal reference genes by using geNorm software

2.4.2 以NormFinder軟件分析

NormFinder軟件的計(jì)算原理與geNorm軟件的相似，M值與基因穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，計(jì)算所得的穩(wěn)定值M越小，說(shuō)明該基因表達(dá)的穩(wěn)定性就越高，并以M值1.5作為該值的閾值，小于1.5的基因都處于穩(wěn)定狀態(tài)中。以Norm Finder軟件分析所得結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在總樣本中，TUB2基因的表達(dá)穩(wěn)定值最小，為0.336，說(shuō)明其表達(dá)穩(wěn)定性最高；在花期樣本中，Actin1基因的表達(dá)穩(wěn)定值最小，為0.237，說(shuō)明其表達(dá)穩(wěn)定性最高；果期樣本中，TUB2基因的表達(dá)穩(wěn)定值最小，為0.262，說(shuō)明其表達(dá)的穩(wěn)定性最高。由以上分析結(jié)果可知，TUB2在總樣本和果期樣本中的表達(dá)均最穩(wěn)定，均為總樣本和果期樣本中最合適的內(nèi)參基因；Actin1在花期樣本中的表達(dá)最穩(wěn)定，是花期樣本最合適的內(nèi)參基因。

2.5 FWL1基因的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證所篩選的內(nèi)參基因在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期中應(yīng)用的有效性，選擇評(píng)價(jià)穩(wěn)定性高的TUB2、Actin1、Actin2和穩(wěn)定性最低的TUB1為內(nèi)參基因，對(duì)FWL1基因在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。以TUB2為內(nèi)參基因時(shí)，目標(biāo)FWL1基因在盛花期和授粉后40 d 時(shí)均表現(xiàn)出相同的顯著性差異水平，不同梨品種的FWL1基因在露紅期和授粉后40 d時(shí)的花托中相對(duì)表達(dá)量的大小順序分別為：在露紅期，鴨梨＞杜梨＞香梨；在授粉后40 d時(shí)，杜梨＞香梨＞鴨梨。以Actin1或Actin2為內(nèi)參基因時(shí)，F(xiàn)WL1的表達(dá)模式與TUB2的校正結(jié)果大部分一致。然而，以穩(wěn)定性最差的TUB1為內(nèi)參基因時(shí)，F(xiàn)WL1在不同梨品種同一花期的表達(dá)模式與TUB2的校正結(jié)果完全不一致。這一分析結(jié)果說(shuō)明，穩(wěn)定性不同的內(nèi)參基因可能影響熒光定量PCR分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至?xí)?dǎo)致分析結(jié)論的錯(cuò)誤。

3 結(jié)論和討論

本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH基因在不同梨品種果實(shí)細(xì)胞分裂期的表達(dá)情況，利用geNorm和NormFinder內(nèi)參分析軟件對(duì)其進(jìn)行了綜合評(píng)估，篩選出了在不同樣本中表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在本實(shí)驗(yàn)體系中，TUB2為果期樣本和總樣本的最適內(nèi)參基因，Actin1為花期樣本的最適內(nèi)參基因，TUB1在本實(shí)驗(yàn)體系中的穩(wěn)定性最差，不適合用作梨果實(shí)細(xì)胞分裂期qRT-PCR分析的內(nèi)參基因。利用篩選出的內(nèi)參基因TUB2，分析FWL1基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明：授粉后40 d時(shí)果肉中的FWL1基因在小果型梨（杜梨）中的表達(dá)水平要高于其在大果型梨（鴨梨）中的表達(dá)水平，此結(jié)果和FWL1基因與梨果實(shí)大小呈反比[11]這一結(jié)果相符合，這進(jìn)一步證實(shí)了TUB2作為理想的內(nèi)參基因可用于梨細(xì)胞分裂期的相關(guān)基因表達(dá)分析。此外，研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)WL1基因在露紅期花托中的表達(dá)水平與果實(shí)大小無(wú)關(guān)，由此推測(cè)，F(xiàn)WL1基因與授粉前子房期的細(xì)胞分裂無(wú)直接關(guān)系。

表3 以geNorm軟件分析得出的8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Table 3 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using geNorm software

表4 以NormFinder軟件分析所得8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Table 4 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using NormFinder software

圖6 利用不同內(nèi)參基因計(jì)算得出的FWL1基因在不同梨品種同一時(shí)期中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of FWL1 in different pear cultivars during the same stage using different internal reference genes

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究的基本手段[30]，通常選擇表達(dá)量恒定的基因作為參照物來(lái)對(duì)定量PCR分析得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，進(jìn)而減小樣本間的檢測(cè)差異[31]。內(nèi)參基因的選擇不具有通用性，不經(jīng)過(guò)篩選直接選擇某個(gè)常見(jiàn)的內(nèi)參基因很可能使定量分析結(jié)果的精確度降低，甚至得到錯(cuò)誤的結(jié)論[2]。前人在梨內(nèi)參基因上已有一定的研究。陳楊楊等人[32]在對(duì)碭山酥梨內(nèi)參基因的篩選中發(fā)現(xiàn)，在高溫和鹽脅迫條件下UBQ在葉片中的表達(dá)最穩(wěn)定，WDP在不同組織器官中的表達(dá)均最穩(wěn)定；張雪等人[33]在對(duì)紅梨果皮組織內(nèi)參基因的篩選中發(fā)現(xiàn)，EF-1α和His均可作為紅梨果皮組織qRT-PCR分析的內(nèi)參基因；Tsuyoshi等人[23]對(duì)日本梨的花芽、花器官、果肉、果皮4個(gè)組織中的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同組織需要選取不同的內(nèi)參基因，這進(jìn)一步說(shuō)明，在分析一個(gè)新實(shí)驗(yàn)體系中的基因表達(dá)情況時(shí)，對(duì)內(nèi)參基因的篩選是十分重要的。雖然以上研究對(duì)象都是梨，但篩選結(jié)果并非某一個(gè)通用內(nèi)參基因。由此可見(jiàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)材料和條件下獲得的梨最穩(wěn)定的內(nèi)參基因存在差異。geNorm和NormFinder軟件均為目前進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的最常使用的軟件，以不同軟件分析得出的這些基因在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期中表達(dá)穩(wěn)定性的排序情況不完全一致，這可能是由不同軟件使用了不同的統(tǒng)計(jì)模型所致的[34-35]。以geNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)，在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期中，Vn/(n+1) 均大于0.15（圖5），楊丹等人[36]也發(fā)現(xiàn)了同樣的問(wèn)題，這可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料來(lái)自不同基因型，跨度較大，從而導(dǎo)致了變異系數(shù)均大于0.15。

筆者分別以梨果實(shí)細(xì)胞分裂不同時(shí)期的杜梨、香梨和鴨梨為材料，對(duì)梨中常用的8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，分析了在該實(shí)驗(yàn)體系中所選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的差異性。內(nèi)參基因的種類(lèi)有很多[37]，本實(shí)驗(yàn)僅篩選了8個(gè)內(nèi)參基因，因此，后續(xù)研究應(yīng)向著擴(kuò)大內(nèi)參基因的篩選范圍以及開(kāi)發(fā)新內(nèi)參基因的方向進(jìn)行，進(jìn)一步尋找適合該實(shí)驗(yàn)體系的內(nèi)參基因，從而為qRT-PCR技術(shù)在梨果實(shí)細(xì)胞分裂期研究中的應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)資料。