川芎揮發(fā)性成分的水蒸氣蒸餾提取與頂空進(jìn)樣GC-MS分析

劉曉芬 張 穎 胡明勛 何志銀 岳美穎

成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明川芎揮發(fā)油具有鎮(zhèn)靜止痛、擴(kuò)張血管、改善心肌供氧、防血栓形成等藥理作用[2]，還具有腦神經(jīng)保護(hù)[3]、抗氧化活性[4]、解熱[5]等作用。川芎總揮發(fā)油對(duì)子宮平滑肌收縮具有顯著的抑制作用[6]。川芎揮發(fā)油是川芎的主要有效成分，是其活血化瘀、行氣止痛的主要有效組分之一，具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，川芎揮發(fā)油中主要含苯酞類、烯萜類、烯醇類以及脂肪酸類化合物[7-9]。

現(xiàn)代多采用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，汪洋[10]比較水蒸氣蒸餾法、中性乙醇提取法與超臨界流體CO2萃取法，發(fā)現(xiàn)水蒸氣蒸餾法獲得的丁基苯酞與藁本內(nèi)酯等苯酞類占總揮發(fā)油的比例相對(duì)更高。冉霞[11]比較水蒸氣蒸餾法與CO2萃取法獲得的揮發(fā)油對(duì)體外瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制能力，發(fā)現(xiàn)水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油抑制能力更強(qiáng)。頂空進(jìn)樣法是將樣品中的揮發(fā)性成分直接導(dǎo)入氣相色譜儀中進(jìn)行分離和檢測(cè)的一種方法，可專一性收集樣品中易揮發(fā)性成分，同時(shí)避免了一些化學(xué)成分因加熱而分解、被氧化等問(wèn)題，可廣泛應(yīng)用于中藥材揮發(fā)性成分的研究[12]。為全面認(rèn)識(shí)川芎中的揮發(fā)性成分，本實(shí)驗(yàn)分別采用水蒸氣蒸餾法和頂空進(jìn)樣法對(duì)川芎揮發(fā)性成分進(jìn)行制備，并對(duì)其進(jìn)行GC-MS分析，比較兩種提取方法制備的川芎揮發(fā)性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 7890A GC System，Agilent Technologies 5975C inert MSD with Triple-Axis Detector；頂空設(shè)備：Agilent 7697A。智能型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，BP121S十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 川芎產(chǎn)自四川省都江堰市石羊鎮(zhèn)金花村3組，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。樣品貯藏于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館。水為樂(lè)百氏純凈水，正己烷(色譜純，成都市科龍化工試劑廠)，無(wú)水硫酸鈉(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備

2.1.1 水蒸氣蒸餾法 精密稱取川芎粉末(過(guò)二號(hào)篩)50 g，參照2015年版中國(guó)藥典(四部)附錄水蒸氣蒸餾法提取，提取揮發(fā)油，所得到的產(chǎn)物為淡黃色油狀物，按每0.1 mL揮發(fā)油加入10 mL正己烷，置棕色瓶中，無(wú)水硫酸鈉除水，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.1.2 頂空進(jìn)樣法 精密稱取1 g川芎粉末(過(guò)二號(hào)篩)置于頂空瓶中密封，置頂空進(jìn)樣器中按頂空進(jìn)樣條件進(jìn)樣。頂空進(jìn)樣條件：加熱箱溫度100 ℃，定量環(huán)溫度120 ℃，傳輸線溫度140℃，樣品瓶平衡時(shí)間30 min，樣品環(huán)平衡時(shí)間0.05 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 水蒸氣蒸餾提取法GC-MS分析條件 Agilent HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，質(zhì)譜檢測(cè)器。載氣氦氣；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；程序升溫：初始60℃，每分鐘5℃升至120℃，每分鐘10℃升至280℃，運(yùn)行時(shí)間28 min。分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件：電離方式電子轟擊(EI)，電子能量70eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，掃描范圍：35～550，全掃描方式。檢索庫(kù)為NIST14.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2.2 頂空GC-MS分析條件 Agilent HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，質(zhì)譜檢測(cè)器。載氣氦氣，柱流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，程序升溫：初始溫度60℃，以8 ℃/min升至220 ℃，運(yùn)行時(shí)間20 min，分流比5∶1。質(zhì)譜條件：電離方式電子轟擊(EI)，電子能量70eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，掃描范圍：50～550，全掃描方式。檢索庫(kù)為NIST14.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 結(jié)果

2種方法制備的揮發(fā)油經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，獲得總離子流圖，分別見(jiàn)圖1和圖2。經(jīng)NIST14.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)檢索，得出揮發(fā)油的化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 頂空進(jìn)樣和水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油GC-MS鑒定化合物及相對(duì)含量

編號(hào)相對(duì)分子量分子式SI值頂空進(jìn)樣水蒸氣蒸餾化學(xué)成分相對(duì)含量/%頂空進(jìn)樣水蒸氣蒸餾1136.23C10H1694-Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,4-methyl-1-(1-methylethyl)-0.56-2136.23C10H169695(+)-α-蒎烯11.120.053136.23C10H169697檜烯37.300.344136.23C10H169697月桂烯1.360.045136.23C10H16-97(+)-2-Carene-0.066136.23C10H1691-α-水芹烯0.14-7136.23C10H169798萜品油烯7.710.438134.22C10H149797鄰-異丙基苯1.870.069136.23C10H1691-3-亞甲基-6-(1-甲基乙基)環(huán)己烯1.02-10136.23C10H1697-(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯0.14-11136.23C10H169497γ-松油烯5.220.3712154.25C10H18O96-trans-Sabinene hydrate0.26-13156.31C11H2491-十一烷0.09-14134.11C10H1494-1,5,8-p-Menthatriene0.13-15150.14C11H1894945-Pentylcyclohexa-1,3-diene7.270.6116154.25C10H18O9695(-)-4-萜品醇0.130.5817154.25C10H18O-90α-松油醇-0.0218136.23C10H16-941,5,5-Trimethyl-6-methylene-cyclohexene-0.2919228.17C13H24O390(Z)-Dec-4-enyl ethyl carbonate-0.0320184.36C13H2897-正十三烷0.31-21150.17C9H10O290-4-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.32-22204.19C15H2491-Elemene isomer0.42-23204.35C15H249090(-)-b-Elemene0.480.1624204.19C15H24-903,5,5,9-Tetramethyl-4a,5,6,7,8,9-hexahydro-2H-benzo[7]annulene-0.3925204.35C15H24-96(-)-g-Elemene-0.1626204.35C15H24-93(E)-β-金合歡烯-0.1027204.35C15H24-90B-柏木烯-0.0628204.35C15H24-95cis-b-Copaene-0.0329204.35C15H249999(+)-b-Selinene2.791.1630204.35C15H2490-Germacrene B0.19-31204.35C15H2493-(Z)-b-Farnesene0.20-32204.35C15H249395Bicyclogermacrene1.130.5333204.35C15H249995(-)-g-蓽澄茄烯0.140.0634204.19C15H24-90Tricyclo[6.3.0.0(2,4)]undec-8-ene, 3,3,7,11-tetramethyl--0.0535196.15C12H20O2-96Hexahydro-3-butylphthalide-0.2136190.24C12H14O291943-丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮0.140.9637214.39C14H30O-911-Tetradecanol-0.0538188.22C12H12O297963-亞丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮0.251.4239192.25C12H16O293-Senkyunolide3.19-40194.13C12H18O290-(3S,3aR)-3-Butyl-3a,4,5,6-tetrahydroisobenzofuran-1(3H)-one0.76-41190.10C12H14O29999E-Ligustilide11.7585.8542228.41C15H32O-911-十五醇-0.20

續(xù)表1

表1 頂空進(jìn)樣和水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油GC-MS鑒定化合物及相對(duì)含量

3 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對(duì)水蒸氣蒸餾提取法和頂空進(jìn)樣法制備的川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析。從表1可知，頂空進(jìn)樣法從川芎揮發(fā)油中共鑒定出29個(gè)化合物，主要是烯萜類和苯酞類成分，烯萜類主要包括檜烯(37.30%)、(+)-α-蒎烯(11.12%)、月桂烯(1.36%)、萜品油烯(7.71%)、萜品烯(5.22%)、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene(7.27%) (+)-b-Selinene(2.79%)、Bicyclogermacrene(1.13%)等成分，約占揮發(fā)油總量76%。苯酞類成分主要包括E-Ligustilide(11.75%)、(3S,3aR)-3-Butyl-3a,4,5,6-tetrahydroisobenzofuran-1(3H)-one(0.76%)、Senkyunolide(3.19%)等，約占揮發(fā)油總量的16%。采用水蒸氣蒸餾法從川芎揮發(fā)油中共鑒定出32個(gè)化合物，主要是烯萜類、苯酞類和脂肪酸類，苯酞類約占揮發(fā)油總量的88%，其中以藁本內(nèi)酯含量最高(85.85%)，烯萜類次之(4.41%)，脂肪酸含量最低(0.17%)。

兩種方法得到14種相同的化合物，但含量差異大。頂空進(jìn)樣法得到(+)-α-蒎烯(11.12%)、檜烯(37.30%)、月桂烯(1.36%)、萜品油烯(7.71%)、γ-松油烯(5.22%)、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene(7.27%)、E-Ligustilide(11.75)，頂空進(jìn)樣法得到(+)-α-蒎烯(11.12%)、檜烯(37.30%)、月桂烯(1.36%)、萜品油烯(7.71%)、γ-松油烯(5.22%)、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene(7.27%)、E-Ligustilide(11.75%)，而水蒸氣蒸餾法得到(+)-α-蒎烯(0.05%)、檜烯(0.34%)、月桂烯(0.04%)、萜品油烯(0.43%)、γ-松油烯(0.37%)、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene(0.61%)、E-Ligustilide(85.85%)。

頂空進(jìn)樣法得到的揮發(fā)性成分含量大于5.0%的化合物有6種，分別是(+)-α-蒎烯(11.12%)、檜烯(37.30%)、萜品油烯(7.71%)、γ-松油烯(5.22%)、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene(7.27%)、E-Ligustilide(11.75)%。水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)性成分含量大于5.0%的化合物只有E-Ligustilide(85.85%)。Senkyunolide是川芎的主要藥效成分[13]，但只有頂空進(jìn)樣法得到該組分，相對(duì)含量為3.19%。

4 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種方法制備的川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分和含量有所不同，水蒸氣蒸餾得到揮發(fā)油性成分是揮發(fā)油，頂空進(jìn)樣是直接由藥材在進(jìn)樣器中得到氣體直接進(jìn)行檢測(cè)，減少了揮發(fā)油的冷藏、除水等中間步驟，減少步驟。頂空進(jìn)樣法制備的川芎揮發(fā)油主要為烯萜類成分，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的主要為苯酞類成分，主要是E-Ligustilide(85.85%)，說(shuō)明兩種方法制備的川芎揮發(fā)性成分各有側(cè)重，推測(cè)造成這種差異可能與揮發(fā)性成分的沸點(diǎn)有關(guān)。水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油耗時(shí)較長(zhǎng)，這使得低沸點(diǎn)揮發(fā)性成分在冷凝過(guò)程中收集時(shí)損失較大。

本實(shí)驗(yàn)首次采用頂空進(jìn)樣GC-MS分析川芎藥材揮發(fā)油組分，通過(guò)將藥材粉末裝入頂空樣品瓶中，加熱平衡后，取揮發(fā)性氣體直接進(jìn)樣分析，具有簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、減少化學(xué)成分加熱分解、轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，能直接獲得藥材中低沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分，且損失較小。水蒸氣蒸餾提取法和頂空進(jìn)樣法這兩種制備方法分別側(cè)重于川芎中不同沸點(diǎn)和不同狀態(tài)下的揮發(fā)性成分，因此，在對(duì)川芎揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS表征時(shí)，應(yīng)分別采用兩種方法進(jìn)行聯(lián)合表征，則可建立更全面的川芎揮發(fā)性成分GC-MS信息。