絞股藍(lán)提取物制備工藝研究

鐘娜娜 吳思平 吳凌鳳 梁 香*

1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514000；2.廣東省梅州市梅縣區(qū)市場監(jiān)督管理局，廣東 梅州 514000

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬藤本植物，號(hào)稱“南方人參”[1-2]，是2002年衛(wèi)生部公布的可用于保健食品的中藥[3]。絞股藍(lán)主要有效成分是絞股藍(lán)皂苷、絞股藍(lán)糖苷、水溶性氨基酸、黃酮類[4]、多種維生素[5]、微量元素、礦物質(zhì)等，有益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒之功效[6]。臨床上發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)具有降血脂、調(diào)血壓、防治血栓、調(diào)節(jié)血糖、促睡眠、緩衰老、防抗癌[7]、提高免疫力、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等多種作用[8]。目前對絞股藍(lán)皂苷提取方法[9]主要有甲醇、正丁醇提取法、生物提取法、超聲提取法、硅膠吸附法、大孔樹脂吸附法[10]等。這些提取方法[11-16]易造成有機(jī)試劑殘留，致使人們服用時(shí)存在較大安全隱患。如用甲醇提取時(shí)溶劑處理不當(dāng)易引起失明、肝病[17]。正丁醇雖然有非常出色的萃取效果，但同樣有著不容忽視的危害，使用不當(dāng)易引起肝皮膚功能異常、嗅覺減退等毒性反應(yīng)[18-19]。不同廠家提取的絞股藍(lán)皂苷質(zhì)量存在較大差異。目前，對絞股藍(lán)皂苷系統(tǒng)的制備工藝的研究甚少，有關(guān)文獻(xiàn)僅是簡單的提取方法的介紹。

基于以上研究背景，本課題采用單因素考察和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相結(jié)合的方式系統(tǒng)研究絞股藍(lán)皂苷提取物的制備工藝，并進(jìn)行三批樣品的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性高，提供的工藝技術(shù)能為后期絞股藍(lán)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化提供參考。

1 儀器與材料

1.1 藥材來源 絞股藍(lán)(批號(hào)：18050801)藥材來源于廣東大森林連鎖藥店有限公司，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物教研室聶華博士鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino干燥全草。

1.2 儀器 HH恒溫水浴鍋(金壇市中大儀器廠)；DW調(diào)溫電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司)；YF3-1型流水式粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；JP-100S型超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；FA2004型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；DHG-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱(常州普天儀器制造有限公司)；UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 材料 無水乙醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)，硫酸(化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑二廠)，香草醛(化學(xué)純，汕頭市光華化學(xué)廠)，人參皂苷Rb1對照品(批號(hào)：110704-200420，中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 建立絞股藍(lán)總皂苷化學(xué)評價(jià)方法

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品制備 將絞股藍(lán)干燥全草粉碎，過50目篩，稱取50 g，加60%乙醇500 mL，回流提取60 min，傾出提取液；藥渣加60%乙醇400 mL，回流提取45 min，傾出提取液，反復(fù)提取六次，合并提取液，濾過兩次，濾液減壓濃縮，得總浸膏。取0.1 g總浸膏，用乙醇溶解定容至500 mL容量瓶，取1 mL溶液至10 mL容量瓶，置80℃水浴中揮干溶劑備用。

2.1.1.2 對照品制備 精密稱取人參皂苷Rb14 mg，用乙醇制成每1 mL含有 2 mg的溶液，備用。

2.1.2 檢測波長的選擇 取對照品溶液與供試品溶液，分別加入8%香草醛乙醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)0.5 mL，77%硫酸溶液5 mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15 min，取出，立即用冰水冷卻10 min，在200～700 nm波長處掃描，結(jié)果顯示對照品溶液和供試品溶液在538 nm處有最大吸收，無干擾，故選擇測定波長為538 nm。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL于10 mL容量瓶，置80℃水浴中揮干溶劑。分別加入8%香草醛乙醇溶液(800 mg香草醛溶于10 mL無水乙醇溶解中，現(xiàn)配現(xiàn)用)0.5 mL，77%硫酸溶液5 mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15 min，取出，立即用冰水冷卻10 min，以隨行試劑為空白，按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部紫外-可見分光光度法(附錄VA)，于538 nm波長處測定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為y=2.9571x+0.0394, 相關(guān)系數(shù)為0.9952，人參皂苷Rb1含量在0.12～0.32 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。結(jié)果如圖1所示。

2.1.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液60 μL，置10 mL容量瓶，按2.1.3.1項(xiàng)下方法測定，重復(fù)6次，RSD值為1.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液5份，照紫外分光光度法測定，重復(fù)5次，RSD值為1.36%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h時(shí)測定，RSD值為1.87%，表明該樣品液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密吸取1 mL已知濃度的樣品溶液置10 mL容量瓶，精密加入樣品量的80%、100%、120%的對照品，分別加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，77%硫酸溶液 5 mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15 min，取出，立即用冰水冷卻10 min，按2.1.3.1項(xiàng)下測定，試驗(yàn)回收率為99.3%，RSD為1.01%，表明此方法加樣回收率良好。

2.1.3.6 樣品的測定 精密量取2.1.1.1項(xiàng)下供試品，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，77%硫酸溶液5 mL，搖勻，密塞，置60℃水浴加熱顯色15 min，取出，立即用冰水冷卻10 min，照紫外分光光度法測定。

2.2 絞股藍(lán)總皂苷制備工藝研究

2.2.1 單因素考察 以乙醇作為提取溶媒，提取工藝選擇乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察。

2.2.1.1 乙醇濃度考察 取15 g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇150 mL，回流提取15 min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測定結(jié)果分析不同乙醇濃度對絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表1。

由表1、圖2可知，以70%乙醇提取的絞股藍(lán)皂苷含量最高，提取率達(dá)9.023%，與80%乙醇和90%乙醇提取率和70%乙醇的提取率接近，但卻降低了乙醇濃度，節(jié)約了成本，故選擇70%乙醇作為絞股藍(lán)皂苷的溶媒濃度。

表1 乙醇濃度考察結(jié)果

2.2.1.2 料液比考察 取15 g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，分別以料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入70%乙醇，回流提取15 min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測定結(jié)果分析不同料液比對絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表2。

由表2、圖2可知，以料液比1:8提取的絞股藍(lán)皂苷含量最高，提取率達(dá)8.493%，故選擇料液比為1∶8的70%乙醇作為絞股藍(lán)皂苷的溶劑用量。

表2 料液比考察結(jié)果

2.2.1.3 提取時(shí)間考察 取15 g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，以料液比1∶8的70%乙醇，分別回流提取15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測定結(jié)果分析不同提取時(shí)間對絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表3。

由表3、圖2可知，提取時(shí)間為 45 min時(shí)提取率最高，可達(dá)8.442%，超過 45 min后，皂苷提取率隨提取時(shí)間的增加而下降，故選擇提取時(shí)間為 45 min。

表3 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.2.1.4 提取次數(shù)考察 取15 g絞股藍(lán)粉末樣品，置圓底燒瓶中，以料液比1∶8的70%乙醇，回流提取45 min，分別提取1次、2次、3次，過濾，收集提取液，置蒸發(fā)皿中蒸干得浸膏，平行操作，通過絞股藍(lán)皂苷含量測定結(jié)果分析不同提取次數(shù)對絞股藍(lán)皂苷提取物提取工藝的影響，結(jié)果見表4。

表4 提取次數(shù)考察結(jié)果

由表4、圖2可知，不同提取次數(shù)下提取絞股藍(lán)，以料液比為1∶8的70%乙醇回流提取4次，每次45 min，絞股藍(lán)皂苷提取率最高，可達(dá)8.892%，與料液比為1∶8的70%乙醇回流提取3次，每次45 min的絞股藍(lán)皂苷提取率相當(dāng)接近，但卻減少了提取次數(shù)，節(jié)約了成本，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化絞股藍(lán)皂苷的提取工藝，根據(jù)相關(guān)資料與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響絞股藍(lán)皂苷的3個(gè)因素，即乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)。每個(gè)因素下各選取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 因素水平表

由表6、表7分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對絞股藍(lán)總皂苷的提取率影響較顯著，影響大小為C>B>A，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇濃度。絞股藍(lán)總皂苷最佳制備工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45 min。

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下最佳提取工藝，制備三批絞股藍(lán)皂苷提取物，照紫外分光光度法測定。由表8可知，采用最佳提取工藝，即料液比為1∶8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45 min，得到的提取物中絞股藍(lán)皂苷提取率為10.25%，表明該工藝重現(xiàn)性好。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析表

表7 方差分析表

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究絞股藍(lán)皂苷的提取工藝，建立了絞股藍(lán)提取物的化學(xué)評價(jià)方法，分別對絞股藍(lán)的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)單因素進(jìn)行考察，以L9(34)正交表設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，篩選出最佳提取工藝為料液比為1∶8的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次45 min；連續(xù)進(jìn)行三批樣品制備，證明該工藝的重現(xiàn)性好；制備了絞股藍(lán)皂苷提取物，為絞股藍(lán)產(chǎn)品化發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐。

通過對絞股藍(lán)指標(biāo)成分含量研究，實(shí)驗(yàn)得出了絞股藍(lán)皂苷提取物，但是研究中仍存在不足。絞股藍(lán)總皂苷約有140余種[20]，其成分的含量測定和成品標(biāo)準(zhǔn)，都以人參皂苷Rb1的多少作為標(biāo)準(zhǔn)。故本文以人參皂苷Rb1為檢測目標(biāo)建立了絞股藍(lán)皂苷的化學(xué)評價(jià)方法和提取工藝，但現(xiàn)有技術(shù)不能指證絞股藍(lán)發(fā)揮神奇療效僅因?yàn)楹腥藚⒃碥誖b1成分。在今后的進(jìn)一步研究中，還需綜合考慮絞股藍(lán)皂苷中的其他成分對人參皂苷Rb1的相互影響，以期找到更完善的絞股藍(lán)皂苷制備工藝。