燈盞花素雜質(zhì)化學(xué)成分研究

黃春球 郭 昕 武正才 謝忠浪 騰利兵

云南植物藥業(yè)有限公司，云南 昆明 650109

燈盞花素為菊科植物短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand. Mazz.)中提取分離得到的原料藥，其是一個(gè)混合物，由野黃芩苷(燈盞花乙素)與其他成分組成，2015版《中國(guó)藥典》一部燈盞花素標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定含野黃芩苷不得低于90.0%(供口服用)或98.0%(供注射用)[1]，除對(duì)野黃芩苷(燈盞花乙素)有含量規(guī)定外，對(duì)其它成分沒(méi)有相關(guān)限度檢測(cè)。燈盞花素對(duì)心腦血管以及肝、腎、肺損傷具有保護(hù)作用。大量研究表明[2]，其保護(hù)缺血再灌注腦組織的可能機(jī)制為保護(hù)神經(jīng)元與防治細(xì)胞毒性、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、緩解腦血管痙攣、改善微循環(huán)，降低血脂、調(diào)節(jié)免疫及減輕炎性反應(yīng)、抗自由基損傷、抑制血小板凝集等作用。

目前，以燈盞花素為原料制成的制劑有片劑、注射劑和注射粉針劑等，臨床應(yīng)用較廣。為了使燈盞花素原料藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和雜質(zhì)成分更加清楚，對(duì)燈盞花素中野黃芩苷(燈盞花乙素)之外的成分進(jìn)行分離，使燈盞花素為原料藥制成的制劑產(chǎn)品物質(zhì)基礎(chǔ)更加清楚，為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步提升及提高產(chǎn)品安全性打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)從燈盞花素中進(jìn)行分離，最終分離得到4個(gè)化合物，經(jīng)光譜鑒定為4'-羥基黃芩素，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，4'-羥基黃芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6-羥基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。

1 儀器與材料

NMR測(cè)試使用Bruker DRX-500和AV-400核磁共振波譜儀；Bruker HCT Esquire 3000離子阱質(zhì)譜儀；大孔吸附樹(shù)脂HPD-100(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)和凝膠Sephadex LH-20，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為Buchi R210(Buchi公司)；樣品檢測(cè)使用GF254 TLC板(青島海洋化工)和Waters 600高效液相色譜儀；甲醇、乙醇等均為工業(yè)純?cè)噭?，燈盞花素由云南植物藥業(yè)有限公司原料車(chē)間提供。

2 提取分離

取燈盞花素1 kg，用3倍量的水，加磷酸氫二鈉溶液至完全溶解，濾過(guò)，濾液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂，依次用水，10%、20%、30%、40%和60%乙醇梯度洗脫，經(jīng)液相檢測(cè)合并得到10%～30%乙醇洗脫段、40%乙醇洗脫段、60%乙醇洗脫段組分，分別合并濃縮至小體積，大孔吸附樹(shù)脂60%乙醇洗脫段濃縮液經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析分離，依次用水、甲醇∶水為10∶90、20∶80、30∶70，40∶60的洗脫劑梯度洗脫，40∶60洗脫段經(jīng)液相檢測(cè)合并相同組分，濃縮至小體積，用磷酸調(diào)pH=2，過(guò)濾，干燥，得到4'-羥基黃芩素(85 mg)；大孔吸附樹(shù)脂40%乙醇洗脫段濃縮液經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析分離，依次用水、甲醇∶水為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的洗脫劑梯度洗脫，30∶70洗脫段經(jīng)液相檢測(cè)合并相同組分，濃縮至小體積，用磷酸調(diào)pH=2，過(guò)濾，干燥，得到芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(124 mg)；大孔吸附樹(shù)脂10%～30%乙醇洗脫段濃縮液經(jīng)反復(fù)凝膠柱層析分離，依次用水、甲醇:水為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的洗脫劑梯度洗脫，20∶80洗脫段經(jīng)液相檢測(cè)合并相同組分，濃縮至小體積，用磷酸調(diào)pH=2，過(guò)濾，干燥，得到4'-羥基黃芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(37 mg)；10∶90洗脫段經(jīng)液相檢測(cè)合并相同組分，濃縮至小體積，用磷酸調(diào)pH=2，過(guò)濾，干燥，得到6-羥基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(47 mg)。

表1 化合物1～4的核磁共振氫譜(500 MHz)和碳譜數(shù)據(jù)(100 MHz)

No. DZH1 DZH2 DZH3 DZH4 δHδCδHδCδHδCδHδC2163.5s164.0s164.3s147.5s36.57(s)102.3D6.81(s)102.5D6.86(s)103.2D135.6s4182.0s182.4s182.0s176.2s5147.0s146.6s161.4s145.6s6129.2s130.4s6.46(D, 1.2)99.1D129.6s7153.3s151.4s162.5s151.3s86.74 (s)93.9D7.00(s)94.1D6.85(D, 1.2)94.6D6.94(s)93.1D9149.7s149.0s157.0s148.2s10104.0s105.8s105.5s105.2s1'121.5s121.3s121.0s121.8s2'7.90 (D,8.5)128.4D7.92(D, 8.3)128.5D7.95(D, 8.6)128.7D8.04(D, 8.0)129.6D3'6.90 (D,8.5)116.0D6.92(D, 8.3)116.0D6.93(D, 8.6)116.0D6.94(D, 8.0)115.5D4'161.0s161.2s161.2s159.3s5'6.90 (D,8.5)116.0D6.92(D,8.3)116.0D6.93(D,8.6)116.0D6.94(D,8.0)115.5D6'7.90(D,8.5)128.4D7.92(D,8.3)128.5D7.95(D,8.6)128.7D8.04(D,8.0)129.6D1″5.12(D,4.8)101.0D5.27(D,7.0)99.4D5.22(D,7.3)99.8D

續(xù)表1

表1 化合物1～4的核磁共振氫譜(500 MHz)和碳譜數(shù)據(jù)(100 MHz)

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末，溶于甲醇；ESI--MS：m/z 285[M-H]-；詳細(xì)的NMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1，通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)仔細(xì)比對(duì)，最終確定該化合物為4'-羥基黃芩素，即4'-hydroxyscutellarin[3]。

化合物2 黃色粉末，微溶于甲醇；ESI+-MS：m/z 471[M+Na]+；詳細(xì)的NMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1，通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)仔細(xì)比對(duì)，最終確定該化合物為4'-羥基黃芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即plantagin[4-5]。

化合物3 淡黃色粉末，溶于甲醇；ESI--MS：m/z 445[M-H]-；詳細(xì)的NMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1，通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)仔細(xì)比對(duì)，最終確定該化合物為芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(燈盞甲素)，即apigenin-7-O-β-D-glucuronide[5-6]。

化合物4 黃色粉末，微溶于甲醇；ESI--MS：m/z 477 [M-H]-；詳細(xì)的NMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1，通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)仔細(xì)對(duì)比，最終確定該化合物為6-羥基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，即6-hydroxykaempferol-7-O-β-D-glucuronopyranoside[7]。