南北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜的研究

郭泰麟 李丹丹 張 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116000

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的干燥根[1]，習(xí)稱北柴胡和南柴胡。原名茈胡，又名山菜、地薰、茹草等[2]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗炎、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]。柴胡作為臨床常用藥物，在解熱和保肝方面用量大。但近年來由于北柴胡野生來源逐漸消失，南柴胡的野生資源基本絕種，市面上常見的南、北柴胡的來源均為人工種植。資源匱乏導(dǎo)致柴胡的價格逐漸上漲，市場內(nèi)偶見使用偽品和正品摻在一起進行銷售的現(xiàn)象。市場上常見的偽品有：蒼蠅花的根[6]、陸地棉的根、野棉花的根[7]、尋骨風(fēng)的根[8]。所以柴胡的質(zhì)量研究逐漸成為熱點問題。北柴胡的主產(chǎn)地在山西、陜西、遼寧等??；南柴胡的主產(chǎn)地在陜西、內(nèi)蒙古、山西、甘肅等地。因此，藥材質(zhì)量的一致性問題也成為臨床用藥選購的重要依據(jù)?，F(xiàn)有文獻中對于柴胡指紋圖譜的建立大多使用VWD或DAD檢測器[9-11]，使用ELSD檢測器同時建立南、北柴胡指紋圖譜的少見報道?；诖祟悊栴}，為保證柴胡質(zhì)量一致性、解決用藥混亂的問題，本實驗對來自不同產(chǎn)地的24批北柴胡和5批南柴胡及其4種偽品通過HPLC-ELSD法分別建立指紋圖譜，鑒定共有指紋峰，分別對不同產(chǎn)地的南北柴胡進行化學(xué)成分一致性的評價，旨在對柴胡藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)；安捷倫G6240B蒸發(fā)光散射檢測器(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LFP-800T高速多功能粉碎機；JD200-3千分之一天平(沈陽龍騰電子有限公司)；Sartourius CP225D 十萬分之一天平。

1.2 試劑 甲醇、乙醇為色譜純(Merck KGaA, 62471 Darmstadt, Germancy)，娃哈哈純凈水，對照品柴胡皂苷a(批號：P03M9F50593)購自上海源葉生物科技有限公司，柴胡皂苷d(批號:PS101397)、柴胡皂苷c(批號：PS000193)、柴胡皂苷f(批號：PS000195)均購自成都普斯生物科技股份有限公司。

1.3 藥材 實驗中所用到24批北柴胡(1-24)、5批南柴胡(25～29)和4批偽品(30～33)收集于全國各地的藥材市場，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張慧教授鑒定為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)及狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的根。具體樣品信息見表1和表2。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 TOSOH TSKgel ODS-100V 色譜柱(4.6mm×150cm，5μm)；乙腈(A)和水(B)為流動相進行梯度洗脫：0～15 min: 20%～30% A， 15～20 min: 30%～35% A，20～35 min: 35%～40% A，35～70 min: 40%～70% A，70～80 min: 70%～75% A,80～85 min: 75%～90% A, 85～90 min: 90%～100% A。流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：20 μL。蒸發(fā)器溫度：30 ℃；霧化器溫度：40 ℃；氣體流速：1.6 mL/min。

2.2 溶液的制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f適量,精密稱定，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至容量瓶刻度線。制成柴胡皂苷a 0.401 mg/mL、柴胡皂苷d 0.415 mg/mL、柴胡皂苷c 0.419 mg/mL、柴胡皂苷f 0.451 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品的制備 取本品粉末(過65目篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，向內(nèi)加入含10%濃氨試液的甲醇液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，濾過，使用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液和濾液合并，在60 ℃回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，使用甲醇定容至容量瓶刻度線，搖勻后過0.45 μm濾，得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性實驗 精密稱取柴胡8號樣品0.5 g，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下方法分別于0、2、4、6、8、12 h間隔進樣。以柴胡皂苷d的保留時間和峰面積為參照，計算相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于1.03%和2.06%。表明本方法精密度良好。

2.4.2 精密度實驗 精密稱取柴胡8號樣品0.5 g，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下方法，連續(xù)測定6次。以柴胡皂苷d的保留時間和峰面積為參照，計算相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于1.57%和2.22%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 精密稱取6份同樣的柴胡8號樣品各0.5 g，分別按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下方法，進樣分析。以柴胡皂苷d的保留時間和峰面積為參照，計算相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，11個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于2.15%和1.53%，說明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的建立 取24批北柴胡和5批南柴胡樣品適量， 按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012 版)分別對24批北柴胡和5批南柴胡樣品進行指紋圖譜的分析。以陜西寶雞野生北柴胡(S4)為參照色譜，生成北柴胡的對照指紋圖譜(圖1)；以山東臨沂產(chǎn)南柴胡(S27)為參照，生成南柴胡的對照指紋圖譜(圖2)。結(jié)果在北柴胡的指紋圖譜中共得到11個共有峰，南柴胡的指紋圖譜上得到14個共有峰。共有峰面積均占指紋圖譜峰面積的90%以上，北柴胡指紋圖譜詳見圖3，南柴胡的指紋圖譜詳見圖4。

3.2 指紋峰的鑒定 經(jīng)查閱文獻和與對照品圖譜的比對，在南、北柴胡指紋圖譜中定出5個成分的結(jié)構(gòu)，分別是柴胡皂苷c(1號峰) ，柴胡皂苷f(2號峰)，柴胡皂苷a(3號峰)，柴胡皂苷e(4號峰)，柴胡皂苷d(5號峰)。

3.3 真?zhèn)舞b別 通過將不同產(chǎn)地的南、北的對照指紋圖譜及其偽品的指紋圖譜(圖5)相比較，二者之間具有顯著性差異。其中蒼蠅花根(S30)、棉花根(S31)和尋骨風(fēng)根(S32)在色譜圖前76分鐘中幾乎無色譜峰，而野棉花根(S33)的色譜峰跟其余三種偽品差別非常明顯。并且四種偽品和正品柴胡的指紋相似度依次為：蒼蠅花根(0.0710)、棉花根(0.257)、野棉花根(0.213)、尋骨風(fēng)根(0.0801)。柴胡及其偽品的指紋圖譜差異較大，所以根據(jù)HPLC-ELSD方法建立的南、北柴胡指紋圖譜可以對柴胡的真?zhèn)芜M行鑒別。

1.柴胡皂苷c 2.柴胡皂苷f 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷e 5.柴胡皂苷d圖1 北柴胡的HPLC-ELSD對照圖譜

1.柴胡皂苷c 2.柴胡皂苷f 3.柴胡皂苷a 4.柴胡皂苷e 5.柴胡皂苷d圖2 南柴胡的HPLC-ELSD對照圖譜

圖4 5批南柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜

圖5 偽品HPLC-ELSD色譜圖

3.4 柴胡指紋圖譜相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012 版)對24批北柴胡、5批南柴胡指紋圖譜進行處理，以陜西寶雞野生北柴胡(S4)為參照，計算11個共有峰的保留時間的相似度；以山東臨沂產(chǎn)南柴胡(S27)為參照，計算14個共有峰的保留時間的相似度。結(jié)果表明，以柴胡皂苷d為參照峰，24批北柴胡、5批南柴胡各個共有峰保留時間RSD為2.51%和3.70%，差異性較小，北柴胡相似度在0.722～0.950之間，南柴胡相似度在0.767～0.927，表明不同產(chǎn)地的南北柴胡均具有一致性,不同產(chǎn)地的北柴胡相似度測定結(jié)果見表3，南柴胡相似度見表4。

表3 北柴胡相似度

表4 南柴胡相似度

3.5 主成分分析

3.5.1 北柴胡的主成分的分析 以北柴胡的HPLC-ELSD指紋圖譜中的11個共有峰峰面積為變量，使用SPSS 24.0軟件進行主成分分析。將特征值及貢獻率作為依據(jù)，根據(jù)載荷量計算綜合得分。北柴胡的主成分特征值及貢獻率結(jié)果見表5。北柴胡中選出了3種主成分，因為這三種主成分對應(yīng)的特征值大于1。3種主成分的累計貢獻率達到了78.3%，說明了這3種主成分可以作為北柴胡質(zhì)量的評價指標。其中主成分1中系數(shù)較大的是X2、X3、X4、X5；主成分2中系數(shù)較大的是X7、X9、X11；主成分3中系數(shù)較大的是X8；說明3個主成分中的8個共有峰對北柴胡質(zhì)量評價貢獻率較大，表明這8個共有峰對24批北柴胡的質(zhì)量影響較大。

表5 北柴胡主成分特征值及貢獻率結(jié)果

3.5.2 南柴胡的主成分分析 以南柴胡的HPLC-ELSD的指紋圖譜中的14個共有峰峰面積為變量，根據(jù)載荷圖計算綜合得分。南柴胡的主成分特征值及貢獻率結(jié)果見表6。南柴胡中選出4種主成分，4種主成份的累計貢獻率達到了100%，說明了這4種主成分可以作為南柴胡質(zhì)量的評價指標。其中主成分1中系數(shù)較大的是X1、X2、X5、X6、X7、X10；主成分2中系數(shù)較大的是X4；說明2個主成分中的7個共有峰對南柴胡質(zhì)量評價貢獻率較大，表明這7個共有峰對5批北柴胡的質(zhì)量影響較大。

表6 南柴胡主成分特征值及貢獻率結(jié)果

4 討論

本文建立了24批北柴胡、5批南柴胡和4批偽品的HPLC-ELSD指紋圖譜，北柴胡提取出11個共有峰，南柴胡提取出14個共有峰。利用中藥指紋相似度評價軟件南北柴胡進行相似度評價，結(jié)果顯示，24批北柴胡相似度為0.722～0.950之間;5批南柴胡的相似度為0.767～0.927之間。表明了不同產(chǎn)地的柴胡具有成分的相似性。同時對柴胡的4種偽品進行了真?zhèn)舞b別，相似度分別為0.0710、0.257、0.213、0.0801。偽品和正品柴胡的相似度差異性大，這表明建立的指紋圖譜可以對柴胡的偽品進行鑒別。

通過SPSS主成分分析的結(jié)果得出，影響北柴胡質(zhì)量的差異性成分有8個，影響南柴胡質(zhì)量差異性成分有7個。在偽品中并未檢測到這些成分，說明通過SPSS得出的質(zhì)量差異性成分同樣可以對南北柴胡的真?zhèn)芜M行鑒別。并且通過對照品的指認和查閱文獻，從這些差異性成分中鑒定出了5種成分，X1為柴胡皂苷c，X2為柴胡皂苷f，X3為柴胡皂苷a，X4為柴胡皂苷e，X5為柴胡皂苷d。在南北柴胡中這五種成分都存在。X2、X3、X4、X5這四種成分對北柴胡的質(zhì)量影響較大，X1、X2、X4、X5這四種成分對南柴胡的質(zhì)量影響較大。

綜上所述，本研究建立的南、北柴胡HPLC-ELSD指紋圖譜及主成分分析得出的影響南北柴胡的質(zhì)量差異性成分，可以為柴胡的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供參考。