miR-195-5p通過PPAP2B調(diào)控肺腺癌的遷移和血管生成

李才弘，楊華軍，劉長路，劉 婭，黃 婷，龔 玲，佘安俊，劉代順,2

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563002;2.遵義市呼吸疾病研究所，貴州 遵義 563002)

肺癌(Lung cancer)是我國乃至全世界最常見的癌癥之一，帶來了沉重的家庭和社會負(fù)擔(dān)[1]。肺癌按生物學(xué)特性主要分為非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)[2-4]。目前治療肺癌的主要手段包括手術(shù)、化療、放療，但均存在一定的局限性，治療效果有限。因此迫切需要尋找新的治療方式，如今因分子生物學(xué)等學(xué)科的進(jìn)步，研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對改善肺癌患者的臨床診治及預(yù)后具有重大意義。

miRNA是長度由18～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，具有多種生物學(xué)功能，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、分化和凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-195-5p作為microRNA家族中重要的一員，在不同病理類型的惡性腫瘤中存在有促癌或抑癌的作用，例如，在子宮內(nèi)膜癌[5]、前列腺癌[6]，肺癌[7]中，miR-195-5p具有抑癌作用，而在結(jié)直腸癌[8]、膀胱癌[9]中，miR-195-5p起到了促癌作用，還參與調(diào)節(jié)骨代謝影響骨密度[9]。目前研究認(rèn)為，miR-195-5p是通過影響細(xì)胞對葡萄糖的攝取，調(diào)控細(xì)胞周期以及影響細(xì)胞分化來發(fā)揮作用[10]。體內(nèi)實驗證明，miR-195-5p的上調(diào)不僅可以通過抑制一些與細(xì)胞周期相關(guān)的基因(MYC、E2F2及其下游基因)的表達(dá)，從而阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程，還可以通過調(diào)控BCL2 、CD40等基因來實現(xiàn)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用[11]。生物信息數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-195-5p可調(diào)節(jié)多種靶基因，通過作用于不同的信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。因此，研究miR-195-5p對肺腺癌的影響，可為肺腺癌的早期診斷、治療及預(yù)后評估尋找新的分子標(biāo)記物，為藥物的開發(fā)帶來理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2019年8月就診于遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的肺腺癌患者30例為研究對象，其中男19例，女11例，平均年齡(61.3±5.1)歲，所有患者均經(jīng)肺穿刺、纖維支氣管鏡或手術(shù)活檢行病理學(xué)檢查明確診斷。選取同期體檢正常人30例作為對照，其中男16例，女14例，平均年齡(63.65±11.2)歲。本研究通過我院倫理委員會的審查及授權(quán)。選取的肺腺癌患者遵循以下納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：①病理診斷為肺腺癌；②TMN分期I期且未經(jīng)過放療或化療；③患者及家屬對研究內(nèi)容知情并同意，簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①拒絕配合者；②排除肝腎功能衰竭和神經(jīng)內(nèi)分泌癌等疾病患者。

1.2 材料與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(購于貴州泰思騰生物科技有限公司)，Lipo-fectamine 3000(購于Invitrogen公司)；人肺腺癌細(xì)胞A549(購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，miR-195-5p模擬物(由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成)；qRT-PCR檢測試劑盒(購于大連TaKaRa公司)，qRT-PCR所需引物(均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成)；VEGF-ELISA檢測試劑盒(購于北京城林生物科技有限公司)。

1.3 標(biāo)本采集 真空采血管采集清晨空腹靜脈血3～4 mL，室溫(18～25℃)靜置后，4℃，3 000 rpm離心10 min，小心轉(zhuǎn)移上層血清至去酶EP管，相同條件重復(fù)離心1次，小心轉(zhuǎn)移上清液至EP管，-80℃冰箱凍存。

1.4 總RNA提取 所有槍頭、EP管均進(jìn)行去酶處理。A549細(xì)胞用1×PBS緩沖液漂洗2～3次，每孔加入1 mL Trizol試劑，移液槍吹打均勻，冰上靜置5 min，加入氯仿200 μL，漩渦振蕩10 s，放冰上靜置5 min，離心15 min(4℃，12 000 rpm)；吸取上層透明水相至新的1.5 mL EP管中，加入與水相同體積的異丙醇，上下顛倒混勻6～8次，放冰上靜置10 min后，離心10 min(4℃，12 000 rpm)，可見管底附著白色沉淀即為總RNA；倒掉上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇，相同條件離心5 min；倒掉上清后，在超凈臺中吹干，加入20 μL DEPC水溶解管底的RNA沉淀；取2 μL樣品于紫外分光光度計上，讀取D260nm/D280nm比值，測定純度及濃度。血清RNA的提取步驟同A549細(xì)胞。

1.5 qRT-PCR檢測miR-195-5p和PPAP2B mRNA的表達(dá) 按照說明書步驟，分別用基因特異RT引物(U6 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′；miR-195-5p 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCAATAT-3′)及通用型逆轉(zhuǎn)錄引物oligo dT prime將500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用DEPC水將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋5倍，采用特異引物(U6上游引物序列為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，下游引物序列為5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′；miR-195-5p上游引物序列為5′- GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3′，下游引物序列為5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，β-actin上游引物序列為5′-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3′，下游引物序列為5′-CTTCGCGGGCGACGAT-3′，PPAP2B上游引物序列為5′-AGGGAGAGCGT-CGTCTTAGT-3′，下游引物序列為5′-AGGATTTGCTCAAGGAGCCC-3′)進(jìn)行PCR 實驗，20 μL反應(yīng)體系(PCR 條件：95℃熱啟動3 min后，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 10 s，40 個循環(huán))，通過2-ΔΔCT方法分析miR-195-5p和PPAP2B基因相對含量。各組 PCR 均進(jìn)行3孔重復(fù)[13]。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞以每孔1×105個接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約50%，按照Lipo-fectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將control NC 和miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，并標(biāo)記為Control組和miR-195-5p mimics組，37℃孵育細(xì)胞48h后提取總RNA，經(jīng)qRT-PCR結(jié)果顯示miR-195-5p mimics組的miR-195-5p表達(dá)較對照組增高3.5倍，分析轉(zhuǎn)染成功。

1.7 細(xì)胞遷移實驗 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，按照每孔2×104個接種于24孔的Transwell小室中，下室中加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去小室中的培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，用棉簽輕輕擦掉小室內(nèi)剩余細(xì)胞，加入甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用清水洗3次，于顯微鏡下觀察，隨機(jī)取6個視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并統(tǒng)計結(jié)果[13]。

1.8 ELISA檢測VEGF蛋白水平 將血清/A549細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，常溫解凍，同時從4℃冰箱中取出酶聯(lián)免疫試劑盒，置于室溫平衡15～30 min，嚴(yán)格按照 ELISA使用說明書[14]，檢測受試者血清、A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF表達(dá)[14-15]。

1.9 Western blot檢測PPAP2B和VEGF水平 棄去培養(yǎng)基，將A549細(xì)胞用冷的PBS洗2次，用配好的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白液后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，按比例加入loading buffer后煮沸，冷卻后放于-20℃冰箱中保存。按每孔20 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后分離的蛋白轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，PBST洗膜后，加入適當(dāng)稀釋比例的PPAP2B、VEGF和β-actin一抗，4℃反應(yīng)并過夜，PBST洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫孵育30 min，PBST洗膜3次，加入顯影液后曝光，用Image J軟件分析電泳條帶。

2 結(jié)果

2.1 miR-195-5p、PPAP2B及VEGF蛋白在正常人和肺腺癌患者血清中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，在肺腺癌血清中miR-195-5p的表達(dá)明顯降低(見圖1A)，而PPAP2B基因的表達(dá)明顯增高(見圖1B)；ELISA結(jié)果顯示，VEGF蛋白在肺腺癌患者血清中表達(dá)明顯增高(見圖1C)。

*：與正常組相比，P<0.05。圖1 正常人和肺腺癌患者血清miR-195-5p、PPAP2B mRNA的表達(dá)及ELISA檢測VEGF蛋白水平

2.2 miR-195-5p成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics后，A549細(xì)胞miR-195-5p的表達(dá)明顯增高(見圖2A)，PPAP2B的mRNA表達(dá)明顯降低(見圖2B)，A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白水平明顯降低(見圖2C)。

2.3 miR-195-5p對A549細(xì)胞遷移力的影響 轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics后，A549細(xì)胞的遷移能力明顯降低(見圖3)。

*：與對照組相比，P<0.05。圖2 轉(zhuǎn)染miR-195-5p后miR-195-5p、PPAP2B基因及VEGF蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)

A:對照組;B:miR-195-5p mimics;C:*：與正常組相比，P<0.05。圖3 轉(zhuǎn)染miR-195-5p對A549細(xì)胞遷移力的影響

2.4 miR-195-5p可能通過靶基因PPAP2B調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞的遷移及下游信號通路 通過targetscan網(wǎng)站預(yù)測，PPAP2B與miR-195-5p在第55-61個堿基序列上有共同的結(jié)合位點(見圖4A)，而PPAP2B位于AKT的上游[16]，蛋白印跡也表明過表達(dá)miR-195-5p后，A549細(xì)胞PPAP2B蛋白表達(dá)降低，VEGF蛋白表達(dá)亦降低(見圖4B、C)。

圖4 miR-195-5p可能的作用靶點及信號通路

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，肺腺癌患者血清中miR-195-5p的表達(dá)比正常人低，而VEGF蛋白的表達(dá)較正常人高。轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics后，A549細(xì)胞遷移能力明顯降低，與張楊等[17]的研究結(jié)果一致。腫瘤組織的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲均依賴新生血管的形成，血管生成受多種生長因子的調(diào)控，其中VEGF是最有效的促血管生長因子[18-19]。VEGF不僅在肺癌患者的血清中表達(dá)上調(diào)，在其他類型的腫瘤如子宮內(nèi)膜癌[20]、胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[21]患者血清中，其表達(dá)也明顯高于正常人，并且VEGF的升高與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，是肺腺癌的潛在分子靶點[22]。轉(zhuǎn)染 miR-195-5p mimics后，VEGF的表達(dá)明顯下調(diào)，分析miR-195-5p能抑制VEGF的表達(dá)而產(chǎn)生抗癌作用，可為肺癌進(jìn)一步深入研究與臨床應(yīng)用提供新的切入點。

miRNAs的一般功能是通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來發(fā)揮某種作用，因此，為進(jìn)一步探索miR-195-5p影響A549細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機(jī)制，本研究通過生物信息數(shù)據(jù)庫對miR-195-5p的潛在靶點進(jìn)行了預(yù)測并通過實驗進(jìn)行初步驗證，結(jié)果顯示，miR-195-5p 與 PPAP2B 在第55-61個堿基序列上有共同的結(jié)合位點 (見圖4A) 。對 PPAP2B進(jìn)行文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，其位于AKT上游[16]，能編碼磷脂酸磷酸水解酶3(Lipid phosphate phosphohydrolase 3,LPP3)，而LPP家族是具有催化各種磷脂酸脫磷酸過程的膜蛋白，通過激活與AKT相關(guān)的信號通路來影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡等。本研究將miR-195-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞中，通過一系列實驗對miR-195-5p的功能進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明miR-195-5p能調(diào)控PPAP2B的表達(dá)，對A549細(xì)胞遷移、血管生成有明顯的抑制作用，但是具體的分子機(jī)制和涉及的信號通路仍需后續(xù)實驗進(jìn)行探索。

本實驗由于臨床樣本量少，僅通過PCR實驗從基因水平了解miR-195-5p在肺腺癌患者血清中的表達(dá)情況，從生物信息數(shù)據(jù)庫分析miR-195-5p與PPAP2B的結(jié)合位點，通過PCR及WB驗證PPAP2B對VEGF的調(diào)控，初步探討了miR-195-5p可能通過調(diào)控PPAP2B，影響下游的AKT/HIF-1a信號途徑[23]，進(jìn)而抑制肺腺癌細(xì)胞遷移和血管新生，對肺腺癌防治靶點的選擇提供新的思路。