免疫相關(guān)LncRNA與膀胱癌預(yù)后關(guān)系分析及預(yù)測模型建立

王 堯，周 旻，柳子川，游 華

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 內(nèi)科，廣東 廣州 510095)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，在我國近年來的發(fā)病率和病死率均呈逐步上升態(tài)勢[1]。在臨床上，高發(fā)于65歲以上的男性，男女發(fā)病比例為3∶1～4∶1。其中70%為非肌層浸潤性膀胱癌，30%為肌層浸潤性膀胱癌。非肌層浸潤性膀胱癌的特征是高復(fù)發(fā)率和低死亡率，而肌層浸潤性膀胱癌中約50%存在潛在致死性[2]。自1976年膀胱灌注卡介苗(BCG)成功應(yīng)用后的數(shù)10年期間，肌層浸潤性、局部晚期和轉(zhuǎn)移性膀胱癌的治療并未取得重要進(jìn)展[3]。近年來，隨著免疫治療的興起，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune check point inhibitors,ICIs)的出現(xiàn)改變了晚期膀胱癌的傳統(tǒng)治療模式[4]，然而其客觀緩解率仍有限，因此結(jié)合免疫相關(guān)因素對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層有助于判斷預(yù)后及治療反應(yīng)。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是指長度大于 200 bp并且不具備蛋白編碼功能的RNA，它在腫瘤免疫應(yīng)答過程如抗原暴露、抗原識(shí)別、免疫激活、免疫細(xì)胞浸潤、腫瘤清除等不同階段中發(fā)揮著廣泛的調(diào)控作用[5]。既往研究表明，多種LncRNA如TP73-AS1、LNMAT2、ITGB1等能夠促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，是潛在治療靶點(diǎn)[6-8]。然而免疫相關(guān)LncRNA在膀胱癌預(yù)后中的作用尚不明確，本研究旨在通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)譜來探索免疫相關(guān)LncRNA與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系并建立預(yù)測模型。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)下載了393例膀胱癌患者腫瘤和正常組織的基因表達(dá)譜及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)。排除總生存期<30 d以及臨床分期不明確的患者，每個(gè)腫瘤組織對(duì)應(yīng)一個(gè)患者。資料采集時(shí)間為2019年10月1日。

1.2 提取免疫相關(guān)LncRNA 通過GSEA網(wǎng)站(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下載免疫相關(guān)基因集(Immune system process M13664,Immune response M19817)，分析提取免疫相關(guān)基因[9]。通過免疫相關(guān)基因-LncRNA共表達(dá)方法鑒定獲得免疫相關(guān)的LncRNA。

1.3 構(gòu)建預(yù)測模型 使用R Survival 包對(duì)單因素分析中具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的LncRNA進(jìn)行多因素分析，根據(jù) Akaike Information Criterion(AIC)確定最優(yōu)的預(yù)測模型。每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分根據(jù)LncRNA表達(dá)水平(exprgene)和多因素分析中加權(quán)線性組合的回歸系數(shù)β來確定，具體計(jì)算公式如下：Risk score =β1gene1×expr(gene1)+β2gene2×expr(gene2)+…+βn geneN×expr(geneN)。采用中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分法分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。

1.4 GSEA和ESTIMATE分析 通過基因富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)分析兩組患者在免疫相關(guān)功能中的富集狀態(tài)，依照基因表達(dá)倍數(shù)改變降序排列。使用ESTIMATE(Estimation of sTromal and immune cells in mAlignant tumors using expression data)方法評(píng)估每個(gè)樣本中免疫細(xì)胞浸潤水平、基質(zhì)細(xì)胞含量及腫瘤純度[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間差異采用log-rank檢驗(yàn)。單因素及多因素生存分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。構(gòu)建ROC曲線并驗(yàn)證模型的擬合程度。采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)觀測兩組免疫相關(guān)基因的分布。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R(3.5.2)軟件，P<0.05(雙側(cè))定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 病例特征 本研究共納入393例膀胱癌患者，其中男性290人(73.8%)，女性103人(26.2%)，平均年齡為68.1歲(34～90歲)。各項(xiàng)臨床病理特征詳見表1。

表1 393例膀胱癌患者的臨床病理特征

指標(biāo)年齡 <60歲 ≥60歲性別 男 女腫瘤分級(jí) 高 低腫瘤分期 Ⅰ Ⅱ Ⅲ IVT分期 T1 T2 T3 T4 不確定淋巴結(jié)受累 N0 N1-N3 Nx遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 M0 M1 Mx例數(shù)(%)85(21.6)308(78.4)290(73.8)103(26.2)374(95.2)19(4.8)2(0.5)123(31.3)137(34.9)131(33.3)4(1.0)113(28.8)189(48.0)58(14.8)29(7.4)227(57.8)126(32.0)40(10.2)185(47.1)10(2.5)198(50.4)

2.2 免疫相關(guān)LncRNA與膀胱癌患者預(yù)后關(guān)系 通過GSEA免疫相關(guān)基因集(Immune system process M13664,Immune response M19817)分析提取TCGA數(shù)據(jù)集中331個(gè)免疫相關(guān)基因，通過免疫相關(guān)基因-LncRNA共表達(dá)方法鑒定獲得531個(gè)免疫相關(guān)的LncRNA(相關(guān)系數(shù)Cor>0.6,P<0.001)。進(jìn)一步通過單因素COX回歸分析篩選出9個(gè)和膀胱癌預(yù)后相關(guān)的LncRNA(見表2)。

表2 單因素COX分析篩選與膀胱癌預(yù)后相關(guān)的免疫相關(guān)LncRNA

LncRNAHRPC1RL-AS1AC093788.1AL021707.6AC024060.1AC104564.3AC009120.2THUMPD3-AS1AL031775.2LINC023210.462 0.445 0.636 0.575 0.431 0.508 0.571 0.475 1.570 0.001 <0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.001

2.3 預(yù)測模型的建立和驗(yàn)證 通過對(duì)上述9個(gè)LncRNA進(jìn)行多因素分析，根據(jù)AIC值確定最終納入模型的5個(gè)LncRNA(見表3)，按照每個(gè)LncRNA的表達(dá)量及回歸系數(shù)β計(jì)算每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(n=196)和低風(fēng)險(xiǎn)組(n=197)。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線，兩組間生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖1A)，高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的5年生存率分別為28.5%和58.1%。高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(見圖1B)及5個(gè)LncRNA的表達(dá)情況(見圖1C)如圖所示。預(yù)測模型的ROC曲線下面積AUC為0.690(見圖2A)。

表3 多因素COX回歸分析篩選出用于構(gòu)建模型的的免疫相關(guān)LncRNA

LncRNAβHRPC1RL-AS1AL021707.6AC024060.1AC104564.3LINC02321-0.37 -0.22 -0.28 -0.45 0.370.69 0.81 0.76 0.64 1.450.0150.0110.0360.0420.005

A:預(yù)測模型的Kaplan-Meier生存曲線；B:高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分；C:5個(gè)免疫相關(guān)LncRNA的表達(dá)熱圖。圖1 預(yù)測模型的生存曲線及分組特征

2.4 高風(fēng)險(xiǎn)組及低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫特征 根據(jù)免疫基因表達(dá)譜進(jìn)行主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫相關(guān)基因的分布具有明顯的差異(見圖2B)。通過GSEA進(jìn)一步分析顯示，在高風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答途徑相關(guān)基因明顯富集(見圖2C、D)。通過ESTIMATE分析發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫評(píng)分高，低風(fēng)險(xiǎn)組較低(見圖3)。高風(fēng)險(xiǎn)組所包含的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多，而腫瘤純度低，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

A：預(yù)測模型的ROC曲線; B：高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中免疫基因的分布; C：免疫應(yīng)答相關(guān)基因的富集分析；D：高風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的富集分析；NSE：標(biāo)準(zhǔn)化富集評(píng)分。圖2 預(yù)測模型的驗(yàn)證及分組免疫特征

圖3 高風(fēng)險(xiǎn)組及低風(fēng)險(xiǎn)組的ESTIMATE分析

3 討論

免疫系統(tǒng)具有識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞的功能，但是腫瘤細(xì)胞能夠通過免疫逃逸和免疫抑制躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，免疫應(yīng)答異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，包括調(diào)節(jié)骨髓造血干細(xì)胞分化及發(fā)育；調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和活化狀態(tài)；調(diào)控細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答；參與自噬、炎癥等過程的激活等[12]。免疫相關(guān)LncRNA對(duì)多種腫瘤的生存預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值，是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[13-14]。

本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中393例膀胱癌患者的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)，通過生存分析和Cox回歸模型，探討了免疫相關(guān)LncRNA與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系。用于構(gòu)建模型的5種免疫相關(guān)LncRNA在單因素及多因素分析中均與患者預(yù)后密切相關(guān)，是患者預(yù)后的獨(dú)立因素。其中LINC02321為危險(xiǎn)基因，C1RL-AS1、AL021707.6、AC024060.1、AC104564.3為保護(hù)基因。先前研究發(fā)現(xiàn)AL021707.6參與了中性粒細(xì)胞自發(fā)凋亡的調(diào)控，相應(yīng)的基因產(chǎn)物也可能成為炎癥反應(yīng)過度的治療靶點(diǎn)[15]。而其它的LncRNA目前無相關(guān)臨床或基礎(chǔ)研究，它們?cè)诎螂装┲械淖饔脵C(jī)制尚不明確，仍有待于進(jìn)一步探索。

膀胱癌的發(fā)病率及臨床特點(diǎn)，如病理分型、組織類型、發(fā)生部位在不同患者中有明顯差異，同一分期的患者預(yù)后也有所不同，因此對(duì)于膀胱癌的預(yù)后因素需要有更多的認(rèn)知。該模型將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，兩組間的生存率具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，預(yù)測模型ROC曲線下面積AUC為0.690，明顯高于其它臨床病理因素，可作為TNM分期的有益補(bǔ)充。

近年來免疫治療在肌層浸潤性膀胱癌領(lǐng)域取得了一系列突破性進(jìn)展，研究表明ICIs的療效有賴于腫瘤的免疫原性，目前在膀胱癌中預(yù)測ICIs療效的標(biāo)志物主要包括：PD-L1的表達(dá)水平、膀胱癌的luminal和basal分型、腫瘤的突變負(fù)荷、ECOG評(píng)分以及轉(zhuǎn)移器官等[16]。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、微淋巴管、組織液、眾多細(xì)胞因子及少量浸潤細(xì)胞等共同構(gòu)成，其中的淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫過程中具有重要作用，本研究通過ESTIMATE分析發(fā)現(xiàn)兩組之間的免疫微環(huán)境組成具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，高風(fēng)險(xiǎn)組的腫瘤微環(huán)境中包含的更多的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，其免疫評(píng)分明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)組。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫相關(guān)基因的分布具有明顯的差異，說明兩組的免疫狀態(tài)不同，并且通過GSEA分析顯示該高風(fēng)險(xiǎn)組中的免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答途徑相關(guān)基因明顯富集，進(jìn)一步提示高風(fēng)險(xiǎn)組具有更強(qiáng)的免疫原性，或許更適合于免疫治療。

綜上所述，我們通過分析免疫相關(guān)LncRNA與膀胱癌患者生存狀態(tài)的關(guān)系并基于此構(gòu)建的預(yù)測模型對(duì)判斷患者的預(yù)后具有重要意義。高風(fēng)險(xiǎn)組及低風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫狀態(tài)存在明顯差異，有可能成為評(píng)估是否適合免疫治療的參考指標(biāo)。該模型的建立為臨床醫(yī)師的治療選擇提供了方便，然而作為一項(xiàng)探索性的研究，其應(yīng)用價(jià)值仍有待于多中心大樣本的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。