膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26對(duì)體外循環(huán)大鼠肺損傷及中性粒細(xì)胞凋亡的影響

張?jiān)?，吳漢華，羅俊麗，郭宇含，程 翅，張 紅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 麻醉醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099)

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass CPB)是心臟外科手術(shù)成功開(kāi)展的良好保障，但急性肺損傷(Acute lung injury ALI)仍然是CPB術(shù)后的主要并發(fā)癥之一[1]。嚴(yán)重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome ARDS)，甚至多器官衰竭，死亡率高達(dá)40%～70%[2]。引起體外循環(huán)肺損傷的因素很多，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為體外循環(huán)引起的肺缺血再灌注損傷與全身性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肺損傷的主要原因[3]。膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1、AnxA1)是一類(lèi)鈣依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，其相對(duì)分子量為37kD，具有抗炎作用[4]。在炎癥性肺部疾病中，AnxA1可由37kDa降解為33kDa小分子產(chǎn)物[5]。大量研究顯示，AnxA1參與多種病理生理過(guò)程，如細(xì)胞增殖與分化、中性粒細(xì)胞趨化及凋亡等[6-7]。Ac2-26是AnxA1 N端模擬肽，具有與AnxA1相似的生物學(xué)效應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，在LPS誘導(dǎo)的肺內(nèi)毒素血癥模型中，膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26預(yù)處理，可減少白細(xì)胞向結(jié)締組織和肺泡腔的滲出，通過(guò)減少TNF-α、IL-6和IL-1的釋放，對(duì)肺有保護(hù)作用。本研究擬通過(guò)觀察膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26對(duì)CPB大鼠肺損傷及中性粒細(xì)胞凋亡的影響，探討其減輕CPB大鼠肺損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26(Tocris公司)，10%中性甲醛(西隴科學(xué))，DAPI染色液(碧云天)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(MDL公司)，TUNEL試劑盒(南京凱基生物)，冰凍切片機(jī)(LEICA)，熒光顯微鏡(日本尼康)，成像系統(tǒng)(日本尼康)，BT100-2J蠕動(dòng)泵(Longer Pump有限公司)，大鼠膜式氧合器(東莞科威醫(yī)療器械有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)，GEM Premier 3000血?dú)夥治鰞x(美國(guó)實(shí)驗(yàn)儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 24只SD雄性大鼠，清潔級(jí)，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0015。實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)嚴(yán)格遵守遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與管理準(zhǔn)則。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)和Ac2-26組(A組)，每組8只。缺血再灌注組和Ac2-26組分別于阻斷左肺門(mén)前30 min靜脈給予等容量0.9%NaCl、AnxA1擬肽Ac2-26(1 mg/kg)[10]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 大鼠用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻藥充分起效后，行尾靜脈穿刺置管，仰臥位固定。行右股動(dòng)靜脈、左股靜脈穿刺置管，明視下行氣管插管，右頸總動(dòng)脈穿刺置管，連接呼吸機(jī)，機(jī)械通氣，參數(shù)設(shè)置：潮氣量12 mL/kg，頻率60次/min，I∶E=1∶2.5，F(xiàn)iO2=99%。建模的兩組大鼠右側(cè)股動(dòng)脈連接生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，右頸總動(dòng)脈連接BT100-2J蠕動(dòng)泵，股靜脈連接大鼠膜式氧合器。行CPB管道預(yù)沖并給予肝素3 mg/k肝素化后，以雙側(cè)股靜脈作為靜脈端引流，右側(cè)頸總動(dòng)脈作為動(dòng)脈端回流，當(dāng)ACT>480 s后，開(kāi)始轉(zhuǎn)機(jī)(維持灌注流量在40 mL/(kg·min))。并循10 min后經(jīng)左側(cè)第四肋間開(kāi)胸，用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉左肺門(mén)(包括左主支氣管、左肺動(dòng)脈和肺靜脈)，并行循環(huán)45 min后松開(kāi)血管夾，開(kāi)放肺門(mén)，并循30 min后，給予魚(yú)精蛋白2～6 mg/kg中和多余肝素后停止體外循環(huán)，停機(jī)觀察90 min實(shí)驗(yàn)結(jié)束。CPB期間維持平均動(dòng)脈壓在50～80 mmHg，灌注流量在40 mL/(kg·min)，監(jiān)測(cè)直腸溫度(維持在32～34℃)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中留置導(dǎo)尿管用于尿液引流并監(jiān)測(cè)大鼠生命體征，維持麻醉深度，根據(jù)生命體征選擇性應(yīng)用血管活性藥物，并根據(jù)血?dú)夥治黾m正酸堿平衡及電解質(zhì)紊亂。分別在CPB開(kāi)始前即刻(T1)、開(kāi)放左肺門(mén)即刻(T2)、CPB結(jié)束后1.5 h時(shí)(T3)采集動(dòng)脈血約0.5 mL，T3時(shí)點(diǎn)取左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心后置于-80℃冰箱中保存待檢，采集的肺組織置于甲醛溶液中固定和-80℃冰箱中保存。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，剝離氣管及肺臟，阻斷右主支氣管，經(jīng)氣管注入0.9%氯化鈉注射液5 mL至左主支氣管及左肺，重復(fù)灌洗左肺3次，回收至少3 mL灌洗液，3 000 rpm離心10 min，取上清液，置于-80℃中保存，用于檢測(cè)BALF中IL-6和總蛋白的含量。

1.3.3 肺功能的檢測(cè) 采集的動(dòng)脈血測(cè)動(dòng)脈血?dú)夥治?，并?jì)算氧合指數(shù)(OI)、呼吸指數(shù)(RI)、肺泡動(dòng)脈氧分壓差(P(A-a)O2)。(OI = PaO2/FiO2RI = P(A-a)O2/PaO2)

1.3.4 病理形態(tài)學(xué)觀察 肺組織用甲醛溶液固定，石蠟包埋后切成3～5 μm薄片，經(jīng)脫水、脫蠟后H&E染色封片，使用光鏡觀察肺組織形態(tài)。隨機(jī)選擇三個(gè)高倍鏡視野觀察肺組織形態(tài)，拍攝并保存圖片。采用Li等[11]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)取平均值，該評(píng)分可反映肺損傷程度。

1.3.5 肺組織中TNF-α、IL-10和BALF中IL-6、總蛋白含量的檢測(cè) ELISA檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-10和BALF中IL-6、總蛋白的含量。準(zhǔn)備試劑樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min，加入終止液比色，15 min之內(nèi)讀OD值，計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。

1.3.6 肺組織中性粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞的凋亡水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，冰凍組織切片固定后，促進(jìn)樣本通透性，在TdT酶作用下熒光素-dUTP與樣本DNA的標(biāo)記反應(yīng)，用DAPI染核，熒光顯微鏡下拍照檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡百分比。

1.3.7 肺組織膜聯(lián)蛋白A1的檢測(cè) Western blot檢測(cè)肺組織AnxA1的表達(dá)。將各組切取的肺組織用PBS漂洗，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后，分別加入一抗膜聯(lián)蛋白A1(1∶2 000)、二抗山羊抗兔抗體(1∶1 000)，曝光觀察蛋白質(zhì)條帶，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺功能比較 與T1時(shí)點(diǎn)比較，三組大鼠T2、T3時(shí)點(diǎn)OI降低，RI、P(A-a)O2升高(P<0.05)。與T2時(shí)點(diǎn)比較，S組T3時(shí)點(diǎn)OI、RI、P(A-a)O2無(wú)明顯差異(P>0.05)；缺血再灌注組和Ac2-26組T3時(shí)點(diǎn)OI降低，RI、P(A-a)O2升高(P<0.05)。T3時(shí)點(diǎn)，缺血再灌注組和Ac2-26組OI較假手術(shù)組降低、而RI、P(A-a)O2較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；Ac2-26組OI較缺血再灌注組升高，而RI、P(A-a)O2較缺血再灌注組明顯降低(P<0.05，見(jiàn)表1)。

組別OI、RI、P(A-a)O2T1T2T3OI(mmHg)418.88±25.46364.25±30.82▲355.97±28.88▲SRI 0.61±0.13 1.06±0.38▲ 1.11±0.17▲P(A-a)O2(mmHg)237.71±34.01281.75±22.38▲285.73±12.56▲OI(mmHg)392.20±26.60293.41±24.95▲a135.38±26.40▲△aIRRI 0.67±0.13 1.46±0.13▲a 4.31±0.72▲△aP(A-a)O2(mmHg)236.09±24.37323.88±41.22▲a500.11±19.83▲△aOI(mmHg)416.49±19.92332.13±40.34▲193.40±28.00▲△abARI 0.54±0.16 1.06±0.25▲ 2.55±0.33▲△abP(A-a)O2(mmHg)236.85±15.01295.34±27.56▲422.72±23.30▲△ab

與T1比，▲：P<0.05；與T2比，△：P<0.05；與S組比較，a：P<0.05；與IR組比較，b：P<0.05。

2.2 大鼠肺組織病理學(xué)變化及病理?yè)p傷評(píng)分 假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁較完整(見(jiàn)圖1A)；缺血再灌注組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡腔充滿水腫液，可見(jiàn)中等量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷程度加重，同時(shí)病理?yè)p傷評(píng)分較假手術(shù)組升高(見(jiàn)圖1B)；Ac2-26組肺組織結(jié)構(gòu)較完整，可見(jiàn)部分肺泡壁斷裂，有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理?yè)p傷評(píng)分較缺血再灌注組下降(見(jiàn)圖1C)；見(jiàn)圖1～2。

A：S組； B：IR組； C：A組;HE染色×200。圖1 大鼠T3時(shí)點(diǎn)肺組織

與S組比較，a：P<0.05；與IR組比較，b：P<0.05。圖2 肺組織病理?yè)p傷評(píng)分比較

2.3 肺組織中TNF-α、IL-10及BALF中IL-6、總蛋白的含量變化 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和Ac2-26組肺組織中TNF-α和BALF中IL-6、總蛋白含量明顯增加，肺組織IL-10顯著降低(P<0.05)；Ac2-26組肺組織中TNF-α和BALF中IL-6、總蛋白含量明顯低于缺血再灌注組，肺組織中IL-10明顯高于缺血再灌注組(P<0.05，見(jiàn)表2)。

組別TNF-α(pg/mL)IL-10(pg/mL)IL-6(pg/mL)總蛋白(mg/mL)S35.10±2.8854.11±3.4426.17±2.801.53±0.18 IR92.88±3.60a33.64±3.04a39.04±2.29a6.89±0.53aA56.11±2.14ab43.18±4.06ab33.64±2.37ab3.48±0.19ab

與S組比較，a：P<0.05；與IR組比較，b：P<0.05。

2.4 肺組織中性粒細(xì)胞的凋亡水平比較 免疫熒光結(jié)果顯示：相較于假手術(shù)組，Ac2-26組和缺血再灌注組中性粒細(xì)胞凋亡率升高，Ac2-26組中性粒細(xì)胞凋亡率明顯高于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3～4)。

藍(lán)色染色為細(xì)胞核；熒光染色為凋亡的中性粒細(xì)胞；紅色染色為CD177標(biāo)記中性粒細(xì)胞；×200。圖3 TUNEL法檢測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞凋亡結(jié)果

與S組比較，a：P<0.05；與IR組比較，b：P<0.05。圖4 肺組織中性粒細(xì)胞凋亡水平比較

2.5 肺組織膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)比較 T3時(shí)點(diǎn)，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組和Ac2-26組肺組織 AnxA1表達(dá)升高(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，Ac2-26組AnxA1表達(dá)升高(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和Ac2-26組肺組織 AnxA1(37kD)表達(dá)下降(P<0.05)，而肺組織 AnxA1(33kD)表達(dá)升高(P<0.05，見(jiàn)表3、圖5)。

組別AnxA1/β-actinAnxA1(37kD)/β-actinAnxA1(33kD)/β-actinS1.194±0.0540.880±0.0090.322±0.018IR1.505±0.107a0.465±0.011a0.979±0.006aA1.972±0.043ab0.674±0.007ab1.289±0.021ab

與S組比較，a：P<0.05；與IR組比較，b：P<0.05。

圖5 肺組織AnxA1蛋白印跡圖

3 討論

CPB引起的肺損傷是術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者術(shù)后臨床轉(zhuǎn)歸[12]。研究表明[13]，CPB后可產(chǎn)生不同程度的呼吸功能不全，表現(xiàn)為肺通氣功能和換氣功能下降，動(dòng)脈氧合不足，肺順應(yīng)性下降，肺組織充血，肺血管周?chē)鲅胺闻菸莸?。文獻(xiàn)報(bào)道[14]，在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型中，支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α及蛋白含量增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，缺血再灌注組大鼠光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，病理?yè)p傷評(píng)分高于假手術(shù)組；大鼠氧合指數(shù)明顯低于假手術(shù)組，而呼吸指數(shù)、肺泡-動(dòng)脈氧分壓差則相反；同時(shí)左肺支氣管肺泡灌洗液里IL-6、總蛋白濃度明顯增加，說(shuō)明CPB后大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損，肺功能下降，肺毛細(xì)血管通透性增加。在CPB過(guò)程中加入Ac2-26后發(fā)現(xiàn)，Ac2-26組大鼠肺功能明顯改善，肺組織損傷程度明顯比缺血再灌注組輕，表明AnxA1擬肽Ac2-26能減輕大鼠CPB肺損傷，對(duì)肺有一定的保護(hù)作用。

在正常條件下，AnxA1主要位于細(xì)胞質(zhì)中無(wú)活性，在炎癥因子的作用下，中性粒細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，刺激大量AnxA1移動(dòng)到細(xì)胞表面，以鈣離子依賴(lài)的方式錨定在細(xì)胞的漿膜上并與粘附分子相互作用，從而抑制白細(xì)胞向炎癥部位遷移，調(diào)節(jié)機(jī)體自身的抗炎作用[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組及Ac2-26組肺組織 AnxA1表達(dá)升高，說(shuō)明CPB導(dǎo)致的強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和缺血再灌注損傷激活了大鼠肺組織內(nèi)源性的AnxA1表達(dá)。應(yīng)用AnxA1肽Ac2-26后，肺組織中AnxA1表達(dá)明顯高于缺血再灌注組，肺功能改善，肺組織炎癥反應(yīng)及損傷程度減輕，提示Ac2-26可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠CPB肺組織AnxA1的表達(dá)，起到與AnxA1相似的抗炎作用，這與Stuqui等[16]研究的結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)[17]，AnxA1的抗炎作用主要是限制炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-6等)產(chǎn)生和白細(xì)胞的聚集，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10， 通過(guò)阻斷中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮黏附與跨內(nèi)皮遷移[18]，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡[19]，減輕組織損傷。CPB后肺組織TNF-α、IL-6等炎癥因子可以直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使毛細(xì)血管通透性增高，促進(jìn)肺水腫，造成組織損傷[20]；IL-10為體內(nèi)重要的抗炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)炎癥方面有著重要的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Ac2-26組大鼠肺組織AnxA1表達(dá)增加的同時(shí)IL-10含量及中性粒細(xì)胞凋亡率明顯高于缺血再灌注組，TNF-α含量則明顯降低，肺損傷則明顯減輕。提示Ac2-26減輕大鼠CPB肺損傷的機(jī)制可能與增加肺組織內(nèi)源性的AnxA1的表達(dá)及抗炎因子IL-10含量，促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述,膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26可減輕大鼠體外循環(huán)肺損傷，其機(jī)制可能與增加肺組織AnxA1表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡減輕肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)。