膜聯(lián)蛋白A1基因敲除加重大鼠體外循環(huán)后肺損傷

吳漢華 ，張?jiān)埽瑒⒖朴?，?良，張 紅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563099；2.遵義市第四人民醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099)

隨著心臟手術(shù)及體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)技術(shù)的提高，心臟病人術(shù)后并發(fā)癥正逐漸減少，但急性肺損傷(Acute lung injury ，ALI)仍然是 CPB 術(shù)后的主要并發(fā)癥之一[1]，重者可發(fā)展為急性呼吸道窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，死亡率高達(dá)50%[2]。CPB肺損傷的具體機(jī)制并不清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要原因是缺血再灌注損傷和全身炎癥反應(yīng)綜合征。

膜聯(lián)蛋白A1(AnxA1)是膜聯(lián)蛋白超家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖分化、凋亡和抗炎癥作用；其廣泛分布在成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)[3]。AnxA1活化后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，與甲?；氖荏w(Formylpeptide receptor，F(xiàn)PR)特異性結(jié)合發(fā)揮作用，通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡，下調(diào)白細(xì)胞在損傷或感染部位的聚集調(diào)節(jié)炎癥的消退[4]。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，AnxA1基因敲除小鼠因?yàn)樵摰鞍椎娜笔?dǎo)致比野生型小鼠更嚴(yán)重的肺部炎癥和纖維化[5]。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)野生型及AnxA1基因敲除型大鼠建立CPB肺損傷模型，觀察AnxA1在CPB肺損傷中的作用，為臨床尋找有效的CPB肺保護(hù)措施提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 全身AnxA1-/-大鼠(KO大鼠)和SD野生型大鼠(WT大鼠)各12只，12～16周齡，體重350～450 g，KO大鼠由上海和元生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0003；SD野生型大鼠由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0015。

1.2 試劑 兔抗大鼠AnxA1單克隆抗體(英國(guó)Abcam)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(武漢三鷹)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法分組：①WT大鼠假手術(shù)組(WT-Sham)；②WT大鼠肺損傷組(WT-IR組)；③KO大鼠假手術(shù)組(KO-Sham組)；④KO大鼠肺損傷組(K0-IR組)，每組6只。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立 所有大鼠術(shù)前禁食12～16 h，自由飲水。根據(jù)本課題組設(shè)計(jì)建立大鼠CPB肺損傷模型[6]，用1%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上，喉鏡明視下確認(rèn)氣管插管成功連接呼吸機(jī)，設(shè)定潮氣量12 mL/kg，呼吸頻率60次/min，吸呼比=1∶2.5，吸入氧濃度：99%。行尾靜脈穿刺置管用于給藥，分離兩側(cè)股靜脈及右側(cè)頸動(dòng)脈并穿刺置管，分離一側(cè)股動(dòng)脈連接生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠生命體征。準(zhǔn)備并安裝好儲(chǔ)血室(20 mL注射器)、蠕動(dòng)泵、硅膠泵管(直徑1.6 mm)、大鼠膜肺及動(dòng)、靜脈管路。20 mL注射器抽取羥乙基淀粉9 mL，鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液1 mL，5%碳酸氫鈉1 mL，甘露醇1 mL預(yù)充CPB管道及實(shí)驗(yàn)用膜式氧合器，排出CPB管道中的氣泡。尾靜脈注射肝素5 mg/kg，連接CPB管道，待激活全血凝固時(shí)間(ACT)≥480 s后，將雙側(cè)股靜脈血液引流至儲(chǔ)血室中，經(jīng)膜肺過濾氧合后，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈輸注回流轉(zhuǎn)機(jī)；10 min后開胸用無(wú)創(chuàng)血管鉗夾閉左側(cè)肺門，轉(zhuǎn)機(jī)45 min后，開放左側(cè)肺門恢復(fù)雙肺通氣，繼續(xù)轉(zhuǎn)機(jī)30 min后經(jīng)尾靜脈注射魚精蛋白中和多余肝素后停止轉(zhuǎn)機(jī)；再持續(xù)機(jī)械通氣90 min后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。CPB期間維持肛溫在32～34 ℃，平均動(dòng)脈壓在50～80 mmHg，灌注流量在40 mL/(kg·min)。術(shù)中密切關(guān)注動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果維持大鼠內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；采用戊巴比妥鈉維持麻醉深度，芬太尼保證術(shù)中鎮(zhèn)痛，維庫(kù)溴銨維持肌松，必要時(shí)應(yīng)用血管活性藥物維持大鼠生命體征。

1.3.3 標(biāo)本采集 分別在體外循環(huán)前(T1)、開放肺門后(T2)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(T3)取動(dòng)脈血行血?dú)夥治?，?jì)算大鼠氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)，術(shù)中記錄大鼠生命體征。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)后處死，取左肺組織，一部分行電鏡和光鏡觀察肺組織損傷程度，一部分行冰凍切片TUNEL法檢測(cè)中性粒細(xì)胞的凋亡率，另外提取組織蛋白行免疫印跡檢測(cè)。

1.3.4 肺組織病理檢查 左肺組織經(jīng)石蠟包埋處理，切成3～5 μm薄片，50%乙醇和正丁醇分別脫水2次，二甲苯脫蠟3次，蘇木精-伊紅(HE)染色后封片。每張病理切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡視野(×100)，采用Cheng C等[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。按照肺泡及肺泡間質(zhì)有無(wú)水腫液和紅細(xì)胞滲出的面積及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度半定量評(píng)估肺損傷的程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分(無(wú))，1分(<25%，間質(zhì)少量中性粒細(xì)胞)，2分(25%～50%，間質(zhì)及部分肺泡腔內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞)，3分(50%～75%，間質(zhì)及大部分肺泡腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞聚集成團(tuán))，4分(>75%)。評(píng)分由兩名未參與實(shí)驗(yàn)的病理科醫(yī)生進(jìn)行，取平均值。

1.3.5 肺組織電鏡檢查 標(biāo)本放入2.5%戊二醛 4℃固定過夜，經(jīng)漂洗后用10%明膠包埋固定，在4℃下用戊二醛固定1 h；脫水后用環(huán)氧樹脂浸透包埋，Leica UC6超薄切片機(jī)切片。最后在110 kV的條件下，用透射電子顯微鏡觀察肺組織并拍攝照片。

1.3.6 TUNEL法檢測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞凋亡率 肺組織固定于10%甲醛過夜。脫水、包埋后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切片，厚度8～10 μm。冰凍切片放入4%多聚甲醛液室溫固定30 min。加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS 1∶9稀釋)覆蓋組織，37℃溫箱孵30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，PBS洗3次。切片上滴加TUNEL試劑，濕盒內(nèi)37℃恒溫孵育2 h。每張切片加適量試劑3(Streptavidin-Fluorescein)覆蓋組織，濕盒內(nèi)37℃溫箱孵育30 min。PBS洗3次。加入0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍。然后滴加與二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS洗3遍。添加抗中性粒細(xì)胞表面特異性蛋白CD177試劑，4℃濕盒內(nèi)過夜，PBS洗3遍。二抗孵育室溫2 h(避光)，PBS洗3遍。最后用DAPI染核10 min，PBS洗3遍，然后直接照熒光片。

1.3.7 免疫印跡法 取出-80℃保存的肺組織，每組各取約100 mg加人約1mL預(yù)冷蛋白裂解液，12 000 rpm離心15 min，取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度并定量。每組蛋白取40μg上樣于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，以濃縮膠100 V，30 min、分離膠120 V，60 min電泳，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。TBS洗膜5 min，置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，將膜分別放入一抗兔抗大鼠AnxA1抗體(1∶1 000)和兔抗大鼠β-actin抗體(1∶1 000)，4℃冰箱孵育過夜。TBST液漂洗3次，每次10 min，加入二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2 000)，37℃孵育1 h。TBST漂洗3次，與顯影液反應(yīng)后，化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，用目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)生命體征的變化

2.1.1 心率的變化 各組同時(shí)點(diǎn)比較：各組大鼠在T1時(shí)刻，心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在T2及T3時(shí)間點(diǎn)，WT-IR組心率較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組心率較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2及T3時(shí)點(diǎn)心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組不同時(shí)點(diǎn)比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時(shí)點(diǎn)心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；WT-IR組和KO-IR組隨著時(shí)間點(diǎn)推移，心率逐漸降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

組別T1T2T3WT-Sham381.67±31.48357.50±37.87360.00±38.60WT-IR375.83±33.30#251.00±41.24?a165.17±39.82?#aKO-Sham363.83±39.42349.83±33.44343.67±32.71KO-IR386.67±34.04#235.17±35.49?b155.50±35.22?#b

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)KO-Sham組比，b：P<0.05。

2.1.2 平均動(dòng)脈壓的變化 各組同時(shí)點(diǎn)比較：各組大鼠在T1時(shí)刻，MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在T2及T3時(shí)間點(diǎn)，WT-IR組MAP較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組MAP較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2及T3時(shí)點(diǎn)MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組不同時(shí)點(diǎn)的比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時(shí)點(diǎn)MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，WT-IR組和KO-IR組隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，在T2及T3時(shí)刻MAP較T1明顯降低(P<0.05)，兩組T3和T2時(shí)刻MAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

組別T1T2T3WT-Sham81.83±8.2376.50±6.8983.83±9.35WT-IR 8.83±10.19#55.67±7.87?a63.17±7.17#?aKO-Sham86.33±8.8081.17±7.7684.83±9.02KO-IR83.17±7.55#54.83±7.11?b59.00±8.65?b

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)KO-Sham組比，b：P<0.05。

2.2 各組大鼠氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)的變化 各組同時(shí)點(diǎn)比較：各組大鼠在T1時(shí)刻，OI和RI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在T2及T3時(shí)間點(diǎn)，WT-IR組OI較WT-Sham組明顯降低(P<0.05)，KO-IR組OI較KO-Sham組明顯下降(P<0.05)，WT-IR組RI較WT-Sham組明顯升高(P<0.05)，KO-IR組RI較KO-Sham組明顯增加(P<0.05)，WT-IR和KO-IR組在T2時(shí)間點(diǎn)OI及RI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在T3時(shí)刻，KO-IR組OI明顯低于WT-IR組(P<0.05)，而RI顯著高于WT-IR組(P<0.05)；各組不同時(shí)點(diǎn)比較：假手術(shù)組WT-sham和KO-Sham組各時(shí)點(diǎn)OI、RI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；WT-IR組和KO-IR組隨著時(shí)間點(diǎn)推移，OI逐漸降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RI逐漸升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3～4。

組別T1T2T3WT-Sham428.33±37.88411.50±27.49414.17±22.78WT-IR445.33±30.75#227.17±39.95?a135.67±27.71?#aKO-Sham424.83±33.77405.17±30.75410.00±39.48KO-IR436.67±32.20#212.00±27.47?b100.67±21.48?#bc

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)KO-Sham組比，b：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)W-IR相比，c:P<0.05。

組別T1T2T3WT-Sham0.34±0.100.39±0.080.37±0.07WT-IR0.29±0.11#1.59±0.41?a3.35±0.90?#aKO-Sham0.33±0.100.40±0.090.41±0.13KO-IR0.33±0.11#1.66±0.39?b4.55±0.95?#bc

與T1比，*：P<0.05；與T2比，#：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)WT-Sham組比，a：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)KO-Sham組比，b：P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)W-IR相比，c:P<0.05。

2.3 各組大鼠肺組織形態(tài)改變及病理?yè)p傷評(píng)分

2.3.1 肺組織形態(tài)學(xué)改變及病理評(píng)分 (H&E)染色光鏡下觀察T3時(shí)刻WT-Sham和KO-Sham組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，可見少量肺泡壁斷裂及炎性滲出；病理?yè)p傷評(píng)分WT-Sham組(1.67±0.52)及KO-Sham組(1.83±0.61)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WT-IR組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁斷裂嚴(yán)重，肺泡腔充滿水腫液，可見大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)；KO-IR組肺組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，肺泡間隔增寬，肺泡腔見大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)，且觀察到炎性細(xì)胞聚集成團(tuán)；KO-IR組病理?yè)p傷評(píng)分(4.91±0.20)高于WT-IR組(4.58±0.20)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1～2。

A：WT-Sham組；B：WT-IR組；C：KO-Sham組；D：KO-IR組。圖1 各組大鼠T3時(shí)刻肺組織光鏡改變(×200)

與WT-Sham組比較，a：P<0.05；與KO-Sham組比較，b：P<0.05；與WT-IR組比較，c：P<0.05。圖2 各組大鼠肺組織損傷評(píng)分比較

2.3.2 肺泡II型上皮細(xì)胞形態(tài)的改變 電鏡下觀察到T3時(shí)刻WT-Sham和KO-Sham組肺泡II型上皮細(xì)胞整體輪廓清楚，界限清晰，胞內(nèi)可見數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)完好的板層小體結(jié)構(gòu)，無(wú)線粒體腫脹。在WT-IR組電子顯微鏡下，觀察到肺泡II型細(xì)胞板層結(jié)構(gòu)數(shù)減少，腫脹增多，可見線粒體水腫。KO-IR組電鏡下可見肺泡II型細(xì)胞數(shù)量較WT-IR組減少，并觀察到肺泡II型上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞碎片，特異性結(jié)構(gòu)板層小體的平行排列板消失，線粒體腫脹明顯，膜外可見殘余的絨毛結(jié)構(gòu)(見圖3)。

A：WT-Sham組；B：WT-IR組；C：KO-Sham組；D：KO-IR組。嗜鋨性板層小體(紅色箭頭)；線粒體(黃色箭頭)；細(xì)胞碎片(藍(lán)色箭頭,bar=2 μm)。圖3 各組大鼠T3時(shí)刻肺組織電鏡改變

2.4 大鼠肺組織中性粒細(xì)胞細(xì)胞凋亡 在WT-Sham組和KO-Sham組僅觀察到少量中性粒細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)凋亡的中性粒細(xì)胞。WT-IR和KO-IR組觀察到中性粒細(xì)胞的凋亡，KO-IR組中性粒細(xì)胞的凋亡率(6.32±2.57%)相較于WT-IR組(17.72±6.35%)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4～5。

2.5 大鼠肺組織AnxA1的表達(dá) T3時(shí)刻WT-IR組肺組織中AnxA1/β-Actin表達(dá)(1.43±0.32)明顯高于WT-Sham組(0.93±0.42)，KO組因?yàn)榍贸讼嚓P(guān)基因，肺組織中并未檢測(cè)到AnxA1的表達(dá)(見圖6)。

與WT-IR組相比，a：P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織中性粒細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)

圖5 TUNEL法檢測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡結(jié)果(×200)

與WT-Sham組相比，a：P<0.05。 圖6 各組大鼠T3時(shí)點(diǎn)肺組織AnxA1的表達(dá)

3 討論

急性肺損傷是CPB后常見的并發(fā)癥之一，其主要表現(xiàn)是肺功能受損和肺組織病理學(xué)改變。臨床上常用OI和RI來評(píng)價(jià)肺功能。RI和OI之間存在負(fù)相關(guān)，兩者的變化都可以反映肺功能的變化。本實(shí)驗(yàn)血?dú)夥治鲇?jì)算顯示：隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，WT-IR組和KO-IR組大鼠的OI逐漸下降低，明顯低于CPB前；RI 則相反；而WT-sham和KO-Sham組各時(shí)點(diǎn)OI和RI無(wú)明顯差異，提示CPB后大鼠肺功能明顯受損。但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，KO-IR組OI明顯低于WT-IR組，而RI顯著高于WT-IR組，說明AnxA1基因敲除大鼠CPB后肺功能受損比野生型大鼠嚴(yán)重。病理切片顯示CPB后WT-IR組及KO-IR組均有肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁斷裂，肺泡腔充滿水腫液，可見大量炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)；但KO-IR組肺組織病理評(píng)分明顯高于WT-IR組。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為肺泡上皮的祖細(xì)胞，不僅可以自我更新，在損傷修復(fù)過程中還可以分化為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞[8]，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞通過合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)，維持肺泡的穩(wěn)定性，在肺內(nèi)免疫中起關(guān)鍵作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，在膿毒癥導(dǎo)致小鼠急性肺損傷的模型中，因肺泡II型上皮細(xì)胞的受損，增加了肺泡氣-血屏障的通透性，從而導(dǎo)致肺泡腔和肺間質(zhì)水腫、出血，大量中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，加重肺損傷。本實(shí)驗(yàn)電子顯微鏡下觀察到兩組大鼠肺泡II型細(xì)胞板層結(jié)構(gòu)視野數(shù)減少，腫脹增多，可見線粒體水腫；KO-IR組可見肺泡II型細(xì)胞數(shù)量較WT-IR組減少，并觀察到肺泡II型上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞碎片，特異性結(jié)構(gòu)板層小體的平行排列板消失，線粒體腫脹明顯，膜外可見殘余的絨毛結(jié)構(gòu)，KO-IR組肺泡II型上皮細(xì)胞受損嚴(yán)重。以上結(jié)果提示：AnxA1基因敲除后加重了大鼠CPB肺損傷。

在CPB期間，血液與CPB人工回路表面的直接接觸會(huì)引起全身炎癥反應(yīng)和肺循環(huán)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞的逐漸積累，中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，促進(jìn)炎癥因子和氧自由基的釋放導(dǎo)致組織損傷[11]。中性粒細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是炎癥消散的關(guān)鍵,是機(jī)體自我限制炎癥反應(yīng)的一種重要方式。有研究表明，CPB開始后中性粒細(xì)胞凋亡明顯減少,且隨著CPB時(shí)間增加，中性粒細(xì)胞凋亡率逐漸下降[12]。 CPB后滯留在肺內(nèi)的中性粒細(xì)胞凋亡受到抑制,生命周期延長(zhǎng),始終處于活化狀態(tài),持續(xù)釋放大量具有組織毒性及酶解基質(zhì)蛋白作用的內(nèi)容物，加重肺組織損傷[13]。CPB后肺組織中性粒細(xì)胞凋亡延遲是導(dǎo)致肺損傷的重要因素。

AnxA1是一種重要的內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，在正常條件下，AnxA1主要位于細(xì)胞質(zhì)中無(wú)活性，發(fā)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，刺激大量AnxA1移動(dòng)到細(xì)胞表面與粘附分子相互作用，通過介導(dǎo)炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，從而抑制炎癥細(xì)胞向炎癥部位聚集，調(diào)節(jié)機(jī)體自身的抗炎作用。AnxA1在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和漿細(xì)胞的胞漿中高表達(dá)[14]，可通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)炎癥的消退。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠急性胸膜炎的實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)源性AnxA1通過激活caspase-3及抑制erk1 /2磷酸化等相關(guān)通路促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡，從而抑制了炎癥[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-IR組和 KO-IR組大鼠CPB 后均觀察到肺組織中性粒細(xì)胞的凋亡，但WT-IR組中性粒細(xì)胞的凋亡率明顯高于KO-IR組，同時(shí)WT-IR組大鼠肺功能及肺組織受損程度比KO-IR組輕；WT-IR組大鼠肺組織AnxA1的表達(dá)明顯高于WT-sham組，KO-IR及KO-sham肺組織未檢測(cè)到AnxA1的表達(dá)。說明CPB后WT-IR組大鼠肺組織AnxA1的表達(dá)增加，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡，肺損傷程度減輕。AnxA1基因敲除后中性粒細(xì)胞的凋亡延遲，肺損傷程度加重。提示：內(nèi)源性的AnxA1通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡，對(duì)CPB肺損傷有積極的抗炎作用。

綜上所述，本研究通過觀察AnxA1基因敲除型大鼠與野生型大鼠CPB后對(duì)肺損傷的影響，發(fā)現(xiàn)基因敲除型大鼠肺損傷明顯加重，提示內(nèi)源性AnxA1對(duì)CPB肺損傷有一定積極的作用。因此深入研究AnxA1或其擬肽藥有望成為CPB肺損傷的一種新的保護(hù)策略。