生菜污染隱孢子蟲(chóng)卵囊洗脫與巢式PCR檢測(cè)方法的研究

李俊強(qiáng)，張凱慧，崔朝輝，王榮軍，菅復(fù)春，張素梅，寧長(zhǎng)申，張龍現(xiàn)

隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)是一種重要的人獸共患腸道原蟲(chóng)，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致多起食源性和水源性隱孢子蟲(chóng)病暴發(fā)[1-2]，主要引起腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，特別是兒童或免疫缺陷病人對(duì)其更為敏感[1,3]。新鮮蔬菜是每日健康飲食中一個(gè)重要的組成部分，也是一些病原重要的傳播媒介[4-5]。近年來(lái)與新鮮蔬菜有關(guān)的食源性疾病相關(guān)報(bào)道數(shù)量急劇增加，大量研究表明許多腸道寄生蟲(chóng)的感染與食入生的或未經(jīng)煮熟的蔬菜具有顯著的相關(guān)性[6-9]。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，在世界范圍內(nèi)時(shí)有隱孢子蟲(chóng)暴發(fā)感染的報(bào)道，溯源研究表明生食蔬菜存在隱孢子蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)[1,10]。然而要檢測(cè)蔬菜表面攜帶的病原體，其洗脫和檢測(cè)方法至關(guān)重要。本研究以生菜為研究對(duì)象，創(chuàng)建了一種巢式PCR檢測(cè)生菜表面的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊的檢測(cè)方法，為蔬菜的食品安全提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1生菜樣品來(lái)源 新鮮生菜樣品分批次購(gòu)自鄭州市區(qū)某大型生活類超市，使用前置于4 ℃冰箱，在購(gòu)置24 h內(nèi)使用完畢。

1.1.2隱孢子蟲(chóng)卵囊 隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)卵囊是由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供，通過(guò)收集隱孢子蟲(chóng)連續(xù)傳代的犢牛糞便，經(jīng)蔗糖及氯化銫(CsCl)密度梯度離心法純化獲得隱孢子蟲(chóng)卵囊[11]。

1.1.3洗滌溶液種類 參照相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]，洗滌液種類有：去離子水；0.1 mol/L 甘氨酸；0.1 mol/L PBS；1% SDS(十二烷基硫酸鈉)；1% Tween-20；1% Alconox。

1.2卵囊計(jì)數(shù)及種植方法 使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡(OLYMPUS CX21)下進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)卵囊計(jì)數(shù)。然后將隱孢子蟲(chóng)卵囊液分別制備為每份4.4×105個(gè)卵囊(體積為100 μL)，用于生菜表面卵囊的人工“種植”。將新鮮生菜樣品(每份25 g)分開(kāi)置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)(避免樣品交叉污染)，使用微量移液器將含有4.4×105個(gè)隱孢子蟲(chóng)卵囊液(100 μL)多點(diǎn)(8～10個(gè))“種植”于生菜表面。每組試驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組(“種植”同體積去離子水)與3個(gè)平行試驗(yàn)組。

1.3卵囊的洗脫方法優(yōu)化 使用BagPage400無(wú)菌過(guò)濾袋(19 cm×30 cm, 400 mL, Interscience Lab. Inc., Boston, MA, US)，洗脫方法在Shields等[13]研究基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。

1.3.1洗脫次數(shù)的比較 制備4份生菜樣本(編號(hào)1～4號(hào))，分別“種植”隱孢子蟲(chóng)卵囊(1號(hào)：去離子水100 μL；2～4號(hào)：卵囊液100 μL)；室溫(15～20 ℃)放置3 h，將生菜樣品轉(zhuǎn)移入BagPage無(wú)菌過(guò)濾袋中，再加入洗滌液(去離子水)100 mL，然后封口并標(biāo)記。振蕩方式設(shè)置為回旋振蕩，振蕩頻率設(shè)置為200次/min，振蕩總時(shí)間為1 h(期間每15 min翻轉(zhuǎn)1次)。振蕩完畢后，將第1次洗脫液轉(zhuǎn)移到2個(gè)50 mL離心管中；再將100 mL洗滌液加入同一過(guò)濾袋充分混勻后，將其洗脫液再轉(zhuǎn)移到另2個(gè)50 mL離心管中，依次進(jìn)行，共進(jìn)行6次洗脫。

1.3.2振蕩方式的優(yōu)化 制備8份生菜樣本(編號(hào)5～12號(hào))，分為2組。分別“種植”隱孢子蟲(chóng)卵囊，室溫放置3 h，將生菜樣品轉(zhuǎn)移入過(guò)濾袋中，再加入洗滌液(去離子水)100 mL。振蕩頻率為200次/min，振蕩時(shí)間為1 h。振蕩方式分別設(shè)置為往返振蕩(5～8號(hào))與回旋振蕩(9～12號(hào))。

1.3.3振蕩頻率的優(yōu)化 制備16份生菜樣本(編號(hào)13～28號(hào))，分為4組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩時(shí)間為1 h。振蕩頻率分別設(shè)置為0次/min(13～16號(hào))、100次/min(17～20號(hào))、200次/min(21～24號(hào))和300次/min(25～28號(hào))。

1.3.4振蕩時(shí)間的優(yōu)化 制備16份生菜樣本(編號(hào)29～44號(hào))，分為4組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩頻率為100次/min。振蕩時(shí)間分別設(shè)置為0 h(29～32號(hào))、0.5 h(33～36號(hào))、1 h(37～40號(hào))和3 h(41～44號(hào))。

1.3.5洗滌液的優(yōu)化 制備28份生菜樣本(編號(hào)45～72號(hào))，分為7組。振蕩方式為往返振蕩，振蕩頻率為100次/min，振蕩時(shí)間分別為1 h。洗滌液分別設(shè)置為去離子水(45～48號(hào))、0.1 mol/L PBS(49～52號(hào))、1% NaCl(53～56號(hào))、1 mol/L甘氨酸(58～60號(hào))、1% SDS(61～64號(hào))、1% Alconox(65～68號(hào))和1% Tween-20(69～72號(hào))。

1.4洗脫液的回收與卵囊計(jì)數(shù) 振蕩完畢之后，將無(wú)菌袋中的第1次洗脫液收集于兩個(gè)50 mL的離心管中，然后再加入與之前該樣品相同的洗滌液，并進(jìn)行充分混勻收集第2次洗脫液。方法1.3.1共進(jìn)行了6次洗脫液的收集，而方法1.3.2～1.3.5中分別進(jìn)行2次洗脫液的收集。將收集洗脫液置于高速離心機(jī)中，3 500 r/min(2 150 g)離心10 min，棄上清，將得到的洗脫液轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中。再將2 mL離心管在15 000 r/min(15 160 g)離心5 min，棄上清，最后濃縮為500 μL洗脫液。最后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本分別計(jì)數(shù)至少3次，求其平均數(shù)。根據(jù)洗脫液的體積計(jì)算其回收的隱孢子蟲(chóng)卵囊總數(shù)，并計(jì)算其總體回收率。

1.5 洗脫液中卵囊DNA提取的優(yōu)化

1.5.1卵囊DNA的提取 制備36份相同數(shù)量的隱孢子蟲(chóng)卵囊液(每份4.4×105個(gè)卵囊)，平均分3組。3種商業(yè)化DNA提取試劑盒分別為：土壤DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil，MP bio)、糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A Stool DNA kit)和組織DNA提取試劑盒(CW0546，康為世紀(jì))，按照說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行病原體DNA的提取。

為比較不同試劑盒提取DNA的含量和純度的穩(wěn)定性，提取的DNA使用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop，ND-1000)測(cè)量其濃度，以及OD260/OD280比值檢測(cè)其純度，每份樣品測(cè)定3次，計(jì)算其平均數(shù)，以及DNA的提取率[15-16]，用平均數(shù)表示。

為比較不同試劑盒提取DNA的敏感性，分別制備不同濃度的隱孢子蟲(chóng)卵囊液103個(gè)、102個(gè)、101個(gè)、100個(gè)(體積：200 μL，溶液：去離子水)，分別使用土壤DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒提取含有不同數(shù)量的隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA。

1.5.2隱孢子蟲(chóng)特異性基因的擴(kuò)增 提取的隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA，使用巢式PCR擴(kuò)增其gp60基因片段[17]。外引物：AL3531(5′-ATAGTCTCCGCTGTATTC-3′)/ AL3534(5′-CGAGGACGGTTCCAAAGG-3′)，內(nèi)引物：AL3532(5′-TCCGCTGTATTCTCAGCC-3′)/AL3533(5′-GAGATATA-TCTTGGTGCG-3′)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為531bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成部合成。PCR擴(kuò)增酶為KOD-Plus-Neo(KOD-401)，模板量為1 μL，兩次PCR的退火溫度均設(shè)定為55 ℃。分別進(jìn)行12份平行樣本的巢式PCR擴(kuò)增，第2次擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于紫外成像儀下進(jìn)行鑒定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所獲得的隱孢子蟲(chóng)卵囊回收率和提取的DNA濃度分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)比較其差異。使用SPSS 22.0軟件，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1不同洗脫次數(shù)的對(duì)比 所檢測(cè)的4份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的1號(hào)樣本使用顯微鏡未檢測(cè)到隱孢子蟲(chóng)卵囊。種植了隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫液中，第1次洗脫回收的隱孢子蟲(chóng)卵囊數(shù)量最多，隨后依次減低；然而到第5次及第6次洗脫液，顯微鏡計(jì)數(shù)顯示均為0(表1)。由此可見(jiàn)，第1次和第2次洗脫液可回收較高的隱孢子蟲(chóng)卵囊(χ2=81.21，P<0.01)。

表1 不同洗滌次數(shù)條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的回收情況
Tab.1 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different elution times

Group IDFirstSecondThirdFourthFifthSixthTotal10000000272.0010.331.670.330084.33378.339.331.330.670089.67470.6712.332.000.670085.67

2.2不同振蕩方式的比較 所檢測(cè)的8份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的5號(hào)和9號(hào)樣本使用顯微鏡未檢測(cè)到隱孢子蟲(chóng)卵囊。種植了隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫液樣本中，往返振蕩和回旋振蕩的回收卵囊的平均值分別為91.33與62.78；其總回收率分別為51.89%和35.67%(表2)。由此可見(jiàn)，采用往返振蕩較回旋振蕩的隱孢子蟲(chóng)卵囊回收率高(χ2=5.20，P<0.05)。

表2 不同振蕩方式條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的回收情況
Tab.2 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation patterns

Group IDOscillation patternsFirstSecondTotalAverage5Roundtrip oscillations00006Roundtrip oscillations81.0012.3393.3391.337Roundtrip oscillations94.339.33103.678Roundtrip oscillations61.0016.0077.009Cyclotron oscillations000010Cyclotron oscillations70.005.3375.3362.7811Cyclotron oscillations53.335.0058.3312Cyclotron oscillations49.675.0054.67

2.3不同振蕩頻率的比較 所檢測(cè)的16份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的13號(hào)、17號(hào)、21號(hào)、25號(hào)樣本使用顯微鏡均未檢測(cè)到隱孢子蟲(chóng)卵囊。種植了隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫液樣本中，振蕩頻率為0次/min、100次/min、200次/min、300次/min，其卵囊回收的平均值分別為64.11、87.78、57.44、54.22；總回收率分別為36.42%、49.89%、32.64%、30.81%(表3)。由此可見(jiàn)，采用振蕩頻率為100次/min時(shí)隱孢子蟲(chóng)卵囊回收率較高(χ2=9.43，P<0.05)。

表3 不同振蕩頻率條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫回收情況
Tab.3 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation frequency

Group IDOscillation frequencytimes/minFirstSecondTotalAverage130000014048.3315.0063.3364.1115034.6714.3349.0016071.009.0080.001710000001810059.6714.0073.6787.781910077.3316.3393.672010083.3312.6796.002120000002220043.3313.3356.6757.442320040.0013.3353.332420052.0010.3362.332530000002630053.339.0062.3354.222730039.6712.3352.002830038.0010.3348.33

2.4不同振蕩時(shí)間的比較 所檢測(cè)的16份生菜樣本洗脫液中，種植了去離子水的29號(hào)、33號(hào)、37號(hào)、41號(hào)樣本使用顯微鏡均未檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊。種植了隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫液樣本中，震蕩時(shí)間為0 h、0.5 h、1 h、3 h的卵囊回收平均值分別為57.78、81.44、95.00、45.67；其總回收率分別為32.84%、46.27%、53.98%、25.95%(表4)。由此可見(jiàn)，采用振蕩時(shí)間為1 h時(shí)隱孢子蟲(chóng)卵囊回收率較高(χ2=19.91，P<0.01)。

2.5不同洗滌液的比較 所檢測(cè)的28份生菜樣本中，種植了去離子水的45號(hào)、49號(hào)、53號(hào)、57號(hào)、61號(hào)、65號(hào)和69號(hào)樣本使用顯微鏡均未檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)卵囊。種植了隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫液樣本中，洗滌液為去離子水、0.1 mol/L PBS、1% NaCl、1 mol/L甘氨酸、1% SDS、1% Tween-20、1% Alconox的卵囊平均回收數(shù)分別為76.11、83.89、87.45、34.11、97.11、84.78、125.67；其總回收率分別為43.24%、47.66%、49.69%、19.38%、55.18%、48.17%、71.40%(表5)。由此可見(jiàn)，采用的洗滌液為1% Alconox時(shí)隱孢子蟲(chóng)卵囊回收率較高(χ2=58.02，P<0.01)，而甘氨酸的回收率最低。

表4 不同振蕩時(shí)間條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫回收情況
Tab.4 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different oscillation time

Group IDOscillation time/hFirstSecondTotalAverage290000030049.009.6758.6757.7831046.006.3352.3332050.6711.6762.33330.50000340.570.6718.3389.0081.44350.551.6716.3368.00360.569.3318.0087.33371000038192.0010.33102.3395.0039182.3310.3392.6740176.3313.6790.00413000042324.679.6734.3345.6743330.0011.0041.0044348.3313.3361.67

2.6生菜表面污染隱孢子蟲(chóng)卵囊總體回收率 采取往返振蕩的振蕩方式，振蕩頻率為100次/min，振蕩時(shí)間為1 h(每15 min翻轉(zhuǎn)1次)，洗脫液采用1% Alconox溶液時(shí)，其隱孢子蟲(chóng)卵囊洗脫回收率達(dá)到最高。血球計(jì)數(shù)板顯微鏡計(jì)數(shù)分別采用第1次和第2次洗脫回收得到隱孢子蟲(chóng)卵囊個(gè)數(shù)之和計(jì)數(shù)，其卵囊總體平均回收個(gè)數(shù)為31.42×104，則其總體回收率最高達(dá)到71.40%(χ2=58.02，P<0.01)(表6)。

2.7 洗脫液中卵囊DNA提取方式的優(yōu)化

2.7.1提取DNA的濃度、純度和提取率比較 3種商業(yè)化試劑盒提取隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA濃度方面，組織DNA試劑盒所提取的DNA平均濃度最高為(23.37±0.91) ng/μL；糞便DNA提取試劑盒提取的DNA濃度次之為(8.28±1.97) ng/μL；土壤DNA提取試劑盒提取的DNA濃度最低為(6.89±2.97) ng/μL。其次，3種試劑盒提取DNA純度方面，組織DNA試劑盒所提取DNA的OD260/OD280平均值最低為1.09±0.70，顯示其蛋白含量較高；糞便DNA提取試劑盒所提取DNA的OD260/OD280平均值適中為1.92±1.28，顯示純度適中；土壤DNA提取試劑盒所提取的DNA的OD260/OD280平均值最高為2.17±3.18，顯示其RNA含量較高。再次，三種試劑盒獲得DNA提取率方面，組織DNA提取試劑盒的DNA平均提取率最高，但其DNA的蛋白含量顯著高；土壤DNA提取試劑盒次之，其提取的DNA中RNA的含量較高；而糞便DNA提取試劑盒提取的DNA提取率最低，但其純度較高(表7)。

表5 不同洗滌液條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫回收情況
Tab.5 Recovery ofCryptosporidiumoocysts by different elution solutions

Group IDElution solutionsFirstSecondTotalAverage45Deionized water000046Deionized water82.339.3391.6776.1147Deionized water50.6712.6763.3348Deionized water63.0010.3373.33490.1 mol/L PBS0000500.1 mol/L PBS74.337.6782.0083.89510.1 mol/L PBS80.004.3384.33520.1 mol/L PBS78.337.0085.33531% NaCl0000541% NaCl82.335.3387.6787.45551% NaCl88.675.0093.67561% NaCl74.676.3381.00571 mol/L Glycine0000581 mol/L Glycine28.005.3333.3334.11591 mol/L Glycine28.335.3333.67601 mol/L Glycine30.005.3335.33611% SDS0000621% SDS92.674.3397.0097.11631% SDS96.337.67104.00641% SDS86.673.6790.33651% Tween-200000661% Tween-2083.335.3388.6784.78671% Tween-2083.003.3386.67681% Tween-2076.003.0079.00691% Alconox○R0000701% Alconox○R126.004.00130.00125.67711% Alconox○R113.673.67117.33721% Alconox○R125.334.33129.67

2.7.2提取DNA的穩(wěn)定性 3種試劑盒提取隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA濃度和純度穩(wěn)定性比較分析顯示：DNA濃度方面，組織DNA提取試劑盒獲得DNA濃度最高，糞便DNA提取試劑盒次之，土壤DNA提取試劑盒最低；其中，土壤DNA提取試劑盒提取DNA濃度的穩(wěn)定性最高。DNA純度方面，土壤DNA提取試劑盒最高，糞便DNA提取試劑盒次之，組織DNA提取試劑盒獲得DNA純度最低；其中，糞便DNA提取試劑盒提取DNA純度穩(wěn)定性最高。

2.7.3提取DNA的特異性 3種試劑盒提取的卵囊DNA為模板的巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，土壤DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒提取的DNA均全部成功擴(kuò)增12份樣品，而組織DNA提取試劑盒提取的DNA僅成功擴(kuò)增4份。由此可見(jiàn)提取水溶液中隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA時(shí)，糞便DNA提取試劑盒和土壤DNA提取試劑盒提取隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的特異性顯著性高于組織DNA提取試劑盒(χ2=71.80，P<0.01)。

2.7.4提取DNA的敏感性 3種試劑盒提取的卵囊DNA樣品敏感性檢測(cè)，只進(jìn)行了兩種試劑盒(糞便DNA提取試劑盒和土壤DNA提取試劑盒)對(duì)于不同梯度的隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的巢式PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示這兩種試劑盒提取的隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的巢式PCR擴(kuò)增的敏感性均為10～100個(gè)卵囊之間。

表6 不同洗滌液條件下隱孢子蟲(chóng)卵囊的回收數(shù)量與回收率
Tab.6 Recovery and rate ofCryptosporidiumoocysts by different elution solutions

Elution solutionsRecovery number and recovery rate of the oocystsFirst recovery number(×104)First recovery rate(%)Second recovery number(×104)Second recovery rate(%)Total recovery number(×104)Total recovery rate(%)Deionized water16.3337.122.696.1219.0343.240.1 mol/L PBS19.3944.061.583.6020.9747.661% NaCl20.4746.531.393.1621.8649.691 mol/L Glycine7.1916.351.333.038.5319.381% SDS22.9752.211.312.9724.2855.181% Tween-2020.1945.890.9742.2121.2048.171% Alconox○R30.4269.131.002.2731.4271.40

表7 不同試劑盒提取DNA的濃度、純度和提取率(n=12)
Tab.7 Concentration, purity and extraction rate of extracted DNA from different kits

DNA kits typesConcentration(ng/μL)Purity(OD260/OD280)Extraction rate(ng/μL)Stool kit8.28±1.97a1.92±1.28d8.28±1.97aSoil kit6.89±2.97a2.17±3.18e6.89±2.97aTissue kit23.37±0.91b1.09±0.70f23.37±0.91b

注：結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一數(shù)據(jù)列中不同小寫(xiě)字母顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

隱孢子蟲(chóng)在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致多起食源性和水源性隱孢子蟲(chóng)病的暴發(fā)[1-2]，并且隱孢子蟲(chóng)的感染與食入生的或未經(jīng)煮熟的蔬菜有顯著的相關(guān)性[6-9]。蔬菜表面攜帶微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)卵囊的報(bào)道最早可以追溯到1997年[18]，到目前仍然有蔬菜表面污染隱孢子蟲(chóng)卵囊的報(bào)道[19-24]。然而要檢測(cè)蔬菜表面攜帶的病原體，首先要建立有效的洗脫和檢測(cè)方法[25]。

本研究對(duì)蔬菜表面污染的隱孢子蟲(chóng)卵囊采取往返振蕩方式，振蕩頻率為100次/min，振蕩時(shí)間為1 h，洗脫液采用1% Alconox的方法進(jìn)行洗脫，其總體回收率最高達(dá)到71.40%。基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)木莓表面攜帶的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊的報(bào)道與本研究得到了相似的結(jié)果，洗脫液為去離子水時(shí)回收率為(43.2±4.5)%；洗脫液為1 mol/L甘氨酸時(shí)木莓表面卵囊回收率為(39.0±7.6)%；洗脫液為去離子水時(shí)菠菜表面卵囊回收率為(47.5±3.1)%；洗脫液為1 mol/L甘氨酸時(shí)菠菜表面卵囊回收率為(50.3±2.0)%；同樣地，洗脫液為1% Alconox時(shí)卵囊回收率最高達(dá)到97.2%[13]。Alconox主要有兩種成分：具有表面活性功能的十二烷基苯磺酸鈉(C12H25C6H4SO3Na)和乳化分散性能的焦磷酸鈉(Na4P2O7)[13]。本研究中，1% Alconox洗脫蔬菜表面的隱孢子蟲(chóng)回收率最高(71.40%)，1% SDS洗脫液次之(55.18%)，并且顯著高于其它洗滌液的回收率。

水溶液中病原體DNA的提取方法有多種，傳統(tǒng)的異丙醇沉淀提取DNA的方法簡(jiǎn)單、成本低、能提取到大量的DNA，但獲得的DNA濃度低、且耗時(shí)長(zhǎng)、純度低、不利于快速的分子生物學(xué)研究，然而試劑盒提取DNA具有快速高效而且純度高的優(yōu)點(diǎn)。目前用于提取糞便、土壤、血液、組織中病原DNA的試劑盒較多[14-15]。本研究選擇3種常見(jiàn)商業(yè)化DNA提取試劑盒對(duì)水溶液中隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA進(jìn)行提取，根據(jù)所提取DNA的濃度、純度和提取率，以及擴(kuò)增微小隱孢子蟲(chóng)gp60基因的特異性和敏感性進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其提取水體中隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的效果。在3種商業(yè)化試劑盒中，雖然組織DNA提取試劑盒獲得的DNA濃度最高，但其擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)gp60基因的特異性顯著低于土壤DNA試劑盒和糞便DNA試劑盒獲得的DNA。推測(cè)可能是由于組織DNA提取試劑盒提取獲得了溶液中其它生物體的基因組DNA，未能將隱孢子蟲(chóng)卵囊壁充分破裂，從而導(dǎo)致未獲得有效隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA。土壤DNA提取試劑盒與糞便DNA提取試劑盒提取的隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA在質(zhì)與量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果考慮到時(shí)間成本，土壤DNA試劑盒耗時(shí)較短；如果考慮到經(jīng)濟(jì)成本，糞便DNA試劑盒提取的單份DNA成本較低。有學(xué)者通過(guò)PCR方法比較了3種試劑盒(FastDNA SPIN Kit for soil，UltraCleanTMSoil DNA Isolation Kit，QIAamp DNA Mini Stool Kit)及一種新建的DNA提取方法提取蔬菜表面洗脫的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示FastDNA試劑盒與土壤DNA試劑盒提取DNA的質(zhì)與量差異也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。

綜上所述，本研究以生菜為研究對(duì)象，對(duì)其表面污染的隱孢子蟲(chóng)卵囊的洗脫方法進(jìn)行了優(yōu)化及水溶液中隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的提取進(jìn)行了比較，建立了巢式PCR檢測(cè)蔬菜表面污染隱孢子蟲(chóng)卵囊的方法，為蔬菜的食品安全提供新的技術(shù)方法。

利益沖突：無(wú)