胡敏酸對土壤中DnBP降解動力學(xué)及微生物活性的影響

李玉雙, 劉厶瑤, 宋雪英, 侯永俠, 徐 碩, 魏建兵, 趙曉旭

(1. 沈陽大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044; 2. 莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院, 福建 莆田 351100)

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters, PAEs)是一類鄰苯二甲酸與醇類生成的酯的統(tǒng)稱,作為重要的增塑劑和軟化劑,被廣泛應(yīng)用于各行業(yè).PAEs具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾和生殖毒性效應(yīng),部分PAEs還具有致癌、致畸、致突變作用,對生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成了極大的危害[1-2].土壤的 PAEs污染主要源于大氣沉降、污水灌溉、垃圾堆放、塑料薄膜使用等直接或間接途徑,使土壤成為 PAEs污染物的匯[3-5].周生賢指出, 我國受污染的耕地約占全國總耕地面積的8.3%[6].調(diào)查數(shù)據(jù)[7-9]顯示,我國多地工農(nóng)業(yè)區(qū)土壤已被PAEs不同程度污染,污灌區(qū)和蔬菜基地土壤污染相對較為嚴(yán)重,其中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-lzethyl hexyl phthaiate,DEHP)和鄰苯二甲酸正二丁酯(di-n-butyl phthaiate, DnBP)2種組分的檢出率和污染程度較高.

腐殖質(zhì)(humicsubstances)是動、植物及微生物殘?bào)w在生物與非生物降解、聚合等作用下形成的天然有機(jī)質(zhì)[10].腐殖質(zhì)是區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的有機(jī)質(zhì)形式,對元素的生物地球化學(xué)循環(huán)等生態(tài)功能均具有重要影響[11].胡敏酸(humic acid, HA)中含有羧基、酚羥基、醇羥基、醌型羥基、酮型羥基等官能團(tuán),具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性,并能夠吸附Cu2+,Pb2+,Cd2+,Zn2+,Ni2+等重金屬離子和持續(xù)有機(jī)污染物[12].Sannino 等[13]在修復(fù)意大利北部老工業(yè)區(qū)時(shí),向土壤中添加外源性胡敏酸,結(jié)果表明,第一次修復(fù)后可提取的有機(jī)污染物降低了70%～90%.也有研究[14]發(fā)現(xiàn)胡敏酸能夠增加有機(jī)污染物的生物有效性,且胡敏酸能夠被菌株共代謝,進(jìn)一步促進(jìn)污染物的微生物降解.閆端[15]向高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PAHs污染土壤中添加胡敏酸,結(jié)果顯示PAHs的解吸效果隨著胡敏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加.可見,胡敏酸與有機(jī)污染物的相互作用對于土壤有機(jī)污染物的修復(fù)具有十分重要的意義.

目前,關(guān)于不同腐殖質(zhì)組分對土壤中DnBP的降解動力學(xué)及土壤微生物活性方面的研究尚鮮見報(bào)道.本文以DnBP為PAEs的代表污染物,采用土壤培養(yǎng)試驗(yàn),研究了腐殖質(zhì)重要組分HA對污染土壤中DnBP的降解動力學(xué)過程、土壤基礎(chǔ)呼吸強(qiáng)度和土壤酶活性的影響規(guī)律,以期為PAEs在土壤中的降解行為及其污染土壤生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自遼寧省沈陽市新民蔬菜基地農(nóng)田,采樣點(diǎn)地理坐標(biāo)為E41° 48′41″;N122°50′47″;采樣深度為0～20 cm.將土壤樣品充分混合均勻,自然風(fēng)干,研磨過2 mm篩,保存?zhèn)溆?土壤類型為潮棕壤,經(jīng)測定,土壤pH值為5.810,有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.010%,總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.210%,總磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.024%.

供試胡敏酸(HA)購于南京都萊生物技術(shù)有限公司;DnBP標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1)購于百靈威科技有限公司;所用丙酮、二氯甲烷、正己烷等有機(jī)試劑購于康科德有限公司,均為色譜純試劑,且經(jīng)色譜檢驗(yàn)無雜峰;無水硫酸鈉(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,在馬弗爐中于400 ℃條件下烘干4 h;玻璃器皿均用重鉻酸鉀洗滌液浸泡、洗凈后于450 ℃烘4 h,備用.

1.2 污染土壤制備

分別向每份50 g的土壤中加入不同質(zhì)量的HA,使土壤中HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10、20、40、80和160 mg·g-1(分別記作H1、H2、H3、H4、H5).充分混合均勻;同時(shí)設(shè)不含HA的對照處理組(CK).

將一定量DnBP溶于丙酮中,配成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的DnBP丙酮溶液,然后按每kg土壤50 mL的比例添加到土壤中,充分混合均勻,放在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干7 d,待丙酮自然揮發(fā)后,再次充分混合均勻,分裝.同時(shí)保留一份50 g左右不加DnBP丙酮溶液的空白土壤于紙袋中.土壤中DnBP處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg·kg-1.

1.3 土壤培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取(15.000±0.005) g土壤樣品于250 mL三角瓶中,將土壤樣品均勻平鋪于錐形瓶底部,按最大持水量60%加入純水.然后用鋁箔紙封口,在鋁箔紙中央打孔,放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng).培養(yǎng)條件為:溫度25 ℃、濕度80%,定期充分補(bǔ)水,維持土壤含水量.

分別于試驗(yàn)第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d將三角瓶用帶有雙通閥的膠塞密封,密閉培養(yǎng)24 h,采集氣體樣品,用于土壤呼吸強(qiáng)度分析.同時(shí)采集土壤樣品,用于土壤酶活力測定和土壤中DnBP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析.將土壤置于紙袋中,于冰箱中4 ℃冷藏保存,3 d內(nèi)完成土壤酶活測定;DnBP質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定前將土壤于室溫風(fēng)干,過孔徑為850 μm(20目)篩,冰箱冷凍保存,備測.

1.4 樣品分析

土壤中DnBP提取采用超聲波提取法[16],提取液中DnBP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析采用氣相色譜法進(jìn)行[17-19].色譜分析條件為:進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測器溫度為300 ℃.柱升溫程序:150 ℃保持0.5 min;以5 ℃·min-1的速率升溫至220 ℃;以3 ℃·min-1的速率升溫至255 ℃;以30 ℃·min-1的速率升溫至280 ℃.保持10 min,載氣流量為1.2 mL·min-1.不分流進(jìn)樣模式,進(jìn)樣體積為1 μL.以3倍信噪比作為方法檢出限,DnBP的檢出限為0.01 mg·kg-1.DnBP加標(biāo)回收率為84.330%～94.420%,土壤空白和試劑空白中目標(biāo)化合物低于檢出限,滿足分析要求.

氣體樣品中CO2釋放量分析采用GC-FID法進(jìn)行[20],氣相色譜儀為CP-7890B(Agilent, USA),色譜柱為Col2:SS-2 m×2 mmPorapak Q(60/80目),檢測器溫度為250 ℃,駐箱溫度為55 ℃,轉(zhuǎn)化器溫度為375 ℃.土壤脫氫酶的測定采用TTC還原法[21];土壤過氧化氫酶的測定采用高錳酸鉀滴定法[22].每個不同HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)土壤處理設(shè)置3個平行樣品.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用最小差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析,采用Microsoft Excel進(jìn)行通徑分析,采用Original 8.5.1進(jìn)行動力學(xué)曲線擬合及制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 DnBP在土壤中的降解動力學(xué)

將DnBP在土壤中的降解動態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,發(fā)現(xiàn)其在土壤中的降解動力學(xué)符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型(見圖1),動力學(xué)方程及相關(guān)參數(shù)列于表1.如表1所示,DnBP的一級降解動力學(xué)方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.9,表明該擬合方程能夠準(zhǔn)確描述土壤中DnBP殘余量與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系.由表中數(shù)據(jù)可以看出,對照處理組(CK)土壤中DnBP降解的半衰期為5.069 d,添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA各處理組的DnBP降解的半衰期為2.833～4.532 d,約為CK的0.559～0.889倍.H1～H4處理,DnBP在土壤中的半衰期隨HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而縮短,而當(dāng)HA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加時(shí)(H5),DnBP的降解半衰期出現(xiàn)了增加的趨勢.這表明HA的添加促進(jìn)了土壤中DnBP的降解,且具有明顯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)效應(yīng),當(dāng)HA添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí),DnBP降解速率減慢.Cervantes等[23]研究表明,在還原態(tài)腐殖質(zhì)存在的情況下,可以較好地降解苯酚、甲酚和石碳酸等污染物;李麗等[24]試驗(yàn)證明,腐殖質(zhì)的存在加速了PAHs的降解和提高了微生物聚生體的礦化速率;這與本文研究結(jié)果相一致.

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后DnBP在土壤中的降解動力學(xué)曲線Fig.1 Degradation kinetics of DnBP in soil after HA treatment

表1 土壤中DnBP的降解動力學(xué)方程
Table 1 The kinetic equation of DnBP degradation in soil

土壤中HA添加量動力學(xué)方程半衰期/d相關(guān)系數(shù)(R2)CKlnCt=4.54773-0.13674t5.0690.903H1lnCt=4.48193-0.16047t4.5320.938H2lnCt=4.46049-0.17007t4.0760.960H3lnCt=4.43475-0.18718t3.7030.971H4lnCt=4.43960-0.24463t2.8330.995H5lnCt=4.45544-0.22322t3.1050.989

注:t為培養(yǎng)時(shí)間,d;Ct為培養(yǎng)t時(shí)間時(shí)土壤中DnBP的質(zhì)量分?jǐn)?shù),mg·kg-1.

2.2 HA對土壤呼吸強(qiáng)度的影響

圖2為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤呼吸強(qiáng)度(CO2釋放量)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化.如圖2所示,空白對照組(CK)土壤呼吸強(qiáng)度始終保持較低水平,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先快速增大而后緩慢減小的趨勢.HA處理各組CO2釋放量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化規(guī)律與CK類似,但HA處理各組土壤呼吸強(qiáng)度均高于對照組,說明HA的添加促進(jìn)了土壤的基礎(chǔ)呼吸.在培養(yǎng)第5～10 d,CO2釋放量快速增加,H1～H4處理組隨著HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,CO2釋放量也增大;在培養(yǎng)第10 d時(shí),CO2釋放量達(dá)到峰值,其中,H4組對土壤呼吸強(qiáng)度促進(jìn)作用最大,約為空白對照組CO2釋放量的1.75倍;而后CO2釋放量逐漸減少.這可能是由于HA提供了碳源,促進(jìn)了土壤呼吸的正向進(jìn)行,碳的分解向土壤中的微生物提供了營養(yǎng),促進(jìn)了微生物的生命活動.孟婷婷等[25]將含有較多天然腐殖酸的褐煤添加到黑土中,其結(jié)果表明褐煤的加入促進(jìn)了土壤的基礎(chǔ)呼吸,與本試驗(yàn)結(jié)果相一致.

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤的呼吸強(qiáng)度CO2釋放量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

Fig.2 Changes in CO2release amount of soil respiration intensity after HA treatment with different mass fractions

2.3 HA對土壤酶活性的影響

2.3.1 HA對土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶是一種氧化還原酶,與土壤呼吸強(qiáng)度、有機(jī)質(zhì)含量等土壤狀況有密切關(guān)系,過氧化氫酶(CAT)可促使H2O2分解為分子氧和水,清除過氧化氫,從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害,是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[26].圖3為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況.如圖3所示,在培養(yǎng)前期(5～10 d),與對照處理組相比,HA處理組過氧化氫酶活性顯著高于對照處理組(p<0.05).培養(yǎng)第5 d時(shí),H1～H5處理組的土壤過氧化氫酶活性比對照處理組分別提升了3.205%、3.846%、3.526%、5.128%和5.449%;培養(yǎng)第10 d時(shí),分別提升了1.357%、2.715%、2.262%、2.866%和3.771%,總體上表現(xiàn)出酶活性隨HA處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大的特征.然而,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,HA處理組與對照處理組之間過氧化氫酶活性的差異減小.HA處理組過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢與對照處理組相似,均表現(xiàn)為5～20 d時(shí)酶活性逐漸增加,20～30 d時(shí)變化幅度不大,而后酶活性顯著降低.藺浩然等[27]得出不同比例蚯蚓糞配施HA對土壤過氧化氫酶有促進(jìn)作用.吳炳孫等[26]研究結(jié)果表明,施用風(fēng)化煤HA可提升土壤過氧化氫酶活性.這些研究結(jié)論與本研究得出的向土壤中施加HA能夠提高土壤過氧化氫酶活性的結(jié)果相一致.

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤過氧化氫酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.3 Change of soil catalase activity with different culture time after HA treatment 注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相關(guān),雙側(cè)).

2.3.2 HA對土壤脫氫酶活性的影響

土壤脫氫酶是各種代謝反應(yīng)的常用酶,借助于有機(jī)物的氧化反應(yīng)制造能量,體現(xiàn)了土壤微生物的整體活性,可以評估微生物的氧化還原能力,能夠反應(yīng)出土壤微生物對有機(jī)物的降解能力的高低.圖4為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤脫氫酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況.如圖4所示,在培養(yǎng)前期(5～15 d),與對照處理組相比,多數(shù)HA處理組脫氫酶活性顯著高于對照處理組(p<0.05).在培養(yǎng)第10 d時(shí),HA處理組脫氫酶活性達(dá)到最大,H1～H4處理表現(xiàn)出酶活性隨HA處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大的特征,而當(dāng)HA用量進(jìn)一步提高(H5),土壤脫氫酶活性有所降低.然而,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,HA處理組與對照處理組之間土壤脫氫酶活性的差異減小,這一變化趨勢與HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對土壤過氧化氫酶活性的影響規(guī)律相似.袁婉潼[28]的研究結(jié)果也表明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)生物腐殖酸能提高土壤酶活性,中量腐殖酸對脫氫酶活性提高作用最好,高量腐殖酸次之.這說明土壤酶活性與HA之間具有明顯的量效關(guān)系,適量施用HA對土壤酶活性的提高有利,而過量施用并不能取得較為理想的效果.

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HA處理后土壤脫氫酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.4 Changes of soil dehydrogenase activity with different culture time after HA treatment 注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相關(guān),雙側(cè)).

2.4 HA用量、土壤酶活性及呼吸強(qiáng)度與DnBP微生物降解的相關(guān)性

HA用量與土壤中DnBP降解率、土壤呼吸強(qiáng)度及土壤酶活性之間的相關(guān)系數(shù)如表2所示.可以看出,土壤中DnBP的降解率與土壤呼吸強(qiáng)度、土壤過氧化氫酶活性之間表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系,與土壤脫氫酶活性之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系;而HA用量與土壤脫氫酶活性之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系;土壤脫氫酶活性與土壤呼吸強(qiáng)度之間也表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系.土壤中DnBP降解率與HA用量、土壤呼吸強(qiáng)度、土壤酶活性之間的通徑系數(shù)如表3所示.通徑分析結(jié)果顯示,土壤呼吸強(qiáng)度和過氧化氫酶與土壤中DnBP降解率之間的直接通徑系數(shù)和綜合通徑系數(shù)均較大,說明其直接作用明顯,并最終表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綜合正向作用.HA用量對土壤中DnBP降解率直接通徑系數(shù)為-0.035,綜合通徑系數(shù)為0.112,說明其直接作用不明顯;但通過其與土壤呼吸強(qiáng)度、過氧化氫酶、脫氫酶之間的相互作用最終表現(xiàn)為間接正向作用.Steiner 等[29]的研究結(jié)果表明,HA存在條件下,對土壤呼吸和土壤酶有激勵作用,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致.

表2 HA用量與土壤中DnBP降解率、土壤呼吸強(qiáng)度及土壤酶活性之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis between soil DnBP and soil enzyme activity and respiration intensity

注: *表示P<0.05,**表示P<0.01(Pearson相關(guān),雙側(cè)).

表3 土壤中DnBP降解率與HA用量、土壤呼吸強(qiáng)度、土壤酶活性之間的通徑系數(shù)Table 3 Path coefficient of HA dosage, respiration intensity and soil enzyme activity on the degradation rate of DnBP in soil

上述分析結(jié)果說明HA的施加促進(jìn)了土壤微生物活動,土壤脫氫酶活性、土壤過氧化氫酶活性和土壤呼吸強(qiáng)度的增加,使菌群的氧化還原能力增強(qiáng),從而加快了土壤中DnBP的降解速率,縮短了DnBP在土壤中的半衰期.這可能主要基于兩方面原因:一方面,HA進(jìn)入土壤后,土壤外源碳含量增加,外源碳的分解向土壤中的微生物提供了營養(yǎng),促進(jìn)了微生物的生命活動[30],從而促進(jìn)了土壤中DnBP的降解;另一方面,HA的分子中存在大量羧基、醇羥基、酚羥基、醌型羥基和酮型羥基等活性官能團(tuán)[31],這些活性官能團(tuán)與土壤中DnBP能夠發(fā)生吸附-解吸等相互作用[32],從而能夠改善土壤微生物活性及其對土壤中DnBP的降解功能.如Chai等[33]報(bào)道腐殖質(zhì)對PAEs的吸附能力與PAEs的性質(zhì)有關(guān),腐殖質(zhì)與PAEs之間的吸附主要以非特異的疏水作用為主;Gao等[34]研究發(fā)現(xiàn)胡敏酸對DnBP的吸附等溫線符合Freundlich模型,其吸附能力隨著溫度和pH值的上升而下降;萬洋[32]研究表明胡敏酸能夠與DnBP形成復(fù)合物.

3 結(jié) 論

DnBP在土壤中的降解符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程,向污染土壤中施加HA促進(jìn)了DnBP的降解,其在土壤中的半衰期縮短.

HA的添加促進(jìn)了DnBP污染土壤的基礎(chǔ)呼吸、土壤過氧化氫酶和脫氫酶酶活性,HA用量與微生物活性指標(biāo)和土壤DnBP降解半衰期之間具有明顯的量效關(guān)系,HA用量過高并不能取得較為理想的效果.

土壤中DnBP的降解率與土壤呼吸強(qiáng)度、土壤過氧化氫酶活性之間表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系,與土壤脫氫酶活性之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系,HA與DnBP降解之間除了直接效應(yīng)外,還存在著間接效應(yīng).