在線固相萃取-二維色譜快速測(cè)定配方奶粉、米粉中維生素D的含量

葉佳明，王京，葉磊海，何斌，仰海青，汪慶旗，陳青俊

1(浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州，310009)2(贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州，310009)

維生素D是固醇類衍生物，主要包括維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)，對(duì)哺乳動(dòng)物具有促進(jìn)鈣磷代謝，抗佝僂病的作用[1-2]，但維生素D攝入過(guò)大，也會(huì)引起高鈣血癥。因此在嬰幼兒配方奶粉、米粉中，維生素D的添加量需要在一合理的范圍內(nèi)。但維生素D化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，溫度、光照等條件的變化會(huì)導(dǎo)致其氧化分解，在嬰幼兒配方奶粉、米粉等基質(zhì)中干擾物質(zhì)較多，維生素D是經(jīng)包埋后再添加到食品基質(zhì)中，因此對(duì)其準(zhǔn)確定量具有較大難度。傳統(tǒng)的分析方法需要皂化破壁、有機(jī)溶劑萃取、濃縮、色譜凈化、正相分離、質(zhì)譜檢測(cè)等較多步驟，操作過(guò)程較為繁瑣、耗時(shí)久，回收率不穩(wěn)定，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性不好[3]。

二維液相色譜具有峰容量大、自動(dòng)化程度高、能夠顯著降低復(fù)雜樣品的基質(zhì)效應(yīng)等特點(diǎn)，已成為生物復(fù)雜樣品的高效分離分析手段，在食品和藥物分析中已得到廣泛的應(yīng)用[4-12]。張艷海等[13-16]、林玉宙等[3]、戚綠葉等[17-20]采用在線二維液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒和成人配方營(yíng)養(yǎng)品中的維生素A、D3和E，已得到較好的應(yīng)用，但在進(jìn)入二維色譜之前需要將皂化液與石油醚進(jìn)行液液萃取，還需要將有機(jī)溶劑進(jìn)行濃縮后才能分析，前處理較為麻煩。本文采用在線固相萃取結(jié)合二維色譜快速測(cè)定嬰幼兒配方奶粉、米粉中的維生素D，簡(jiǎn)化了前處理的操作步驟，提高了方法的準(zhǔn)確性和樣品的處理效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1260液相色譜儀，配置SPE泵、一維泵、二維泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、DAD檢測(cè)器(配大流通池)、柱溫箱、2個(gè)六通閥。SPE柱，一維色譜柱：Aglient Poroshell 120 EC-C8(4.6 mm×100 mm，4 μm)，二維色譜柱：Aglient Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)。磁力攪拌器，上海碩光電子科技有限公司。

維生素D2、維生素D3：純度>98%，Dr.Ehrenstorfer。KOH、95%乙醇、抗壞血酸、BHT均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、乙腈、甲醇均為色譜純，美國(guó)Fisher公司；去離子水(18.2 MΩ·cm),Mil-lipore 純水機(jī)制得。

1.2 樣品預(yù)處理

奶粉樣品：稱取5 g樣品于250 mL圓底燒瓶中，加入10 mL溫水，渦旋1 min，使樣品充分溶解，加入1 g抗壞血酸、0.1 g BHT，25 mL無(wú)水乙醇和5 mL 500 g/L KOH水溶液，80 ℃皂化30 min，冷卻后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇水溶液定容。過(guò)0.22 μm濾膜后待測(cè)。

米粉樣品：稱取5 g樣品于250 mL圓底燒瓶中，加入10 mL溫水，渦旋1 min，加入0.5 g淀粉酶，60 ℃酶解30 min，余下步驟參照奶粉樣品操作。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量維生素 D2、D3標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)水乙醇溶解并定容至25 mL，使其質(zhì)量濃度約為100 μg/mL，臨用前，參照GB 5009.82—2016[21]方法對(duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行校正，分別吸取1 mL維生素 D2、D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL棕色容量瓶中，以無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻。分別用1 cm石英比色皿，以無(wú)水乙醇為空白參比，在264 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A)，按公式(1)計(jì)算其校正后的濃度(X)，維生素D2、D3的1%比色光系數(shù)E分別485和462。

(1)

取上述校準(zhǔn)后標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液適量，分別加體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇水溶液進(jìn)行稀釋，制成各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.20 μg/mL。

1.4 儀器條件

柱溫30 ℃, 進(jìn)樣量100 μL。SPE泵流動(dòng)相：A為水B為乙醇，一維分析泵的流動(dòng)相: A為水,B為乙腈;流速為1.50 mL/min二維分析泵的流動(dòng)相: A 為乙腈，B為甲醇，流速為0.40 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng): 264 nm; 系統(tǒng)管路如圖1所示。梯度洗脫程序見(jiàn)表1,閥切換時(shí)間見(jiàn)表2。

圖1 在線固相萃取二維柱切換系統(tǒng)流路示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

應(yīng)用二維色譜測(cè)定乳制品中的脂溶性維生素已得到一定的應(yīng)用[2-3,13-20]，其關(guān)鍵技術(shù)在于系統(tǒng)流路的構(gòu)建和色譜條件的確定。林玉宙等[3]、張艷海等[13-16]、戚綠葉等[17-18]均采用二維液相色譜分離的中心切割法，通過(guò)一維色譜柱實(shí)現(xiàn)初步分離后，將含有維生素D的餾出物切割至二維色譜柱中進(jìn)行進(jìn)一步分離，達(dá)到凈化的目的，為本文系統(tǒng)流路的構(gòu)建和色譜條件的確定提供了參考。但其方法樣品溶液在進(jìn)入二維色譜之前需要先將皂化液與石油醚進(jìn)行液液萃取，萃取后還需經(jīng)水洗除雜、脫水、濃縮、定容等步驟才能分析，前處理較為繁瑣，不便于批量操作，有一定的局限性。

表1 SPE、一維系統(tǒng)、二維系統(tǒng)洗脫程序

表2 閥切換時(shí)間和位置

本文采用在線固相萃取-二維色譜測(cè)定配方奶粉、米粉中維生素D的含量。樣品經(jīng)過(guò)皂化定容后，可直接進(jìn)樣分析，樣品溶液經(jīng)在線SPE柱凈化后，通過(guò)六通閥轉(zhuǎn)入在一維色譜柱中，在一維色譜柱實(shí)現(xiàn)初步分離后，將維生素D的餾出物轉(zhuǎn)移至二維色譜柱中進(jìn)行二次分離(如圖1所示)。為了提高維生素D在SPE柱上的凈化效果，本文考察了甲醇、乙腈和乙醇的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙腈對(duì)脂溶性物質(zhì)溶解性更低，洗脫能力較弱，雜質(zhì)在SPE柱上保留較強(qiáng)，使用甲醇和乙腈作為淋洗溶劑時(shí)，在一維色譜中發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)更多，最終確定乙醇水作為洗脫溶劑，通過(guò)梯度洗脫，先用高水相淋洗除去皂化液中的堿液和大部分水溶性雜質(zhì)，再用高有機(jī)相將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)，通過(guò)六通閥進(jìn)入一維色譜。

一維色譜分離在色譜柱規(guī)格選擇上，應(yīng)選擇高柱效色譜柱，有助于壓縮譜峰，提高分離度，使得峰寬變窄，縮短閥切換時(shí)間窗口，減少一維色譜中雜質(zhì)進(jìn)入二維色譜。與C18柱相比C8柱出峰更快，因此一維色譜可以選擇對(duì)脂溶性物質(zhì)保留更弱的C8柱，流動(dòng)相選用乙腈水，可將維生素D2和維生素D3壓縮成一個(gè)峰，縮短閥切換時(shí)間窗口。為了確定一維色譜準(zhǔn)確閥切換時(shí)間，可通過(guò)進(jìn)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，先測(cè)定維生素D在一維色譜中的出峰時(shí)間，為保證樣品中維生素D全部切割至第2個(gè)六通閥的捕獲柱中，將時(shí)間適當(dāng)調(diào)寬，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)進(jìn)樣，考察了保留時(shí)間波動(dòng)范圍，確定了最終的切換時(shí)間窗口為11.35～11.9 min，閥切換時(shí)間和位置見(jiàn)表2。

通過(guò)第二個(gè)六通閥的捕獲柱可以減少進(jìn)入二維色譜的溶劑量，避免峰過(guò)度展寬，在二維分離體系中應(yīng)考慮流動(dòng)相的兼容性，以及一維分離機(jī)理和二維分離機(jī)理的差異性。因此本文二維色譜采用 Agilent Eclipse PAH(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱，該色譜柱以優(yōu)異的分離性能在生育酚、類胡蘿卜素等脂溶性物質(zhì)分離中有較好的應(yīng)用。并以甲醇和乙腈作為流動(dòng)相可以在短時(shí)間內(nèi)較好分離雜質(zhì)、維生素D2和維生素D3，滿足檢測(cè)要求(如圖2所示)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖

2.2 方法的線性范圍、儀器定量限、精密度考察

分別吸取適量校準(zhǔn)好的維生素D2和D3儲(chǔ)備液，至10 mL棕色量瓶中，制成維生素D系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液; 結(jié)果顯示，維生素D2在0.002～0.20 μg/mL范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)R為0.999 7，維生素D3在0.002～0.20 μg/mL 范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，表明各目標(biāo)物線性關(guān)系良好。按S/N=10確定維生素D2和維生素D3的定量限濃度，推算出維生素D2的定量限為0.38 μg/100 g，維生素D3的定量限為0.40 μg/100 g。均小于GB 5009.82—2016[11]第三法中維生素D的定量限(維生素D2定量限3 μg/100 g、維生素D3定量限0.6 μg/100 g)。取 0.05 μg/mL維生素D2、D3的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣10次，計(jì)算得到維生素D2和D3峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.88%和0.92%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3 回收率

準(zhǔn)確稱取 5 g嬰幼兒配方奶粉和配方米粉，分別按5.0、10、20 μg/100 g三種水平添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，測(cè)定維生素D2和維生素D3的含量，計(jì)算回收率。表3結(jié)果顯示，維生素 D2的加標(biāo)回收率為91.3%～96.3%，RSD為1.9%～3.9%; 維生素 D3的加標(biāo)回收率為91.6%～97.2%，RSD為1.6%～3.1%,表明該方法回收率高、穩(wěn)定性較好。

表3 樣品中維生素D 的含量及其加標(biāo)回收率(n=6)

注：“ND”表示未檢出

表4 本方法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法樣品檢測(cè)結(jié)果的偏差 單位：μg/100 g

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定及與標(biāo)準(zhǔn)方法比較

分別采用本法和我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分析方法(GB 5009.82—2016第三法)對(duì)10種嬰幼兒配方奶粉和米粉中維生素D含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，分別對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明奶粉樣品t計(jì)=0.560，米粉樣品t計(jì)=0.381，查T檢驗(yàn)臨界值表t表(9,0.05)=2.262，P>0.05。t檢驗(yàn)表明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明2種方法對(duì)奶粉和米粉中維生素D的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論

本文建立了在線固相萃取結(jié)合二維色譜快速測(cè)定嬰幼兒配方奶粉、米粉中維生素D含量的方法。樣品溶液皂化后定容，無(wú)需復(fù)雜操作，通過(guò)儀器自動(dòng)凈化分析檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)配方奶粉、米粉中維生素D的快速測(cè)定。通過(guò)本方法檢測(cè)得到維生素D的加標(biāo)回收率為91.3%～97.2%，RSD小于5%，方法定量限為0.40 μg/100 g，滿足檢測(cè)要求，并通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)法與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。本方法操作簡(jiǎn)便、快速，自動(dòng)化程度高，重現(xiàn)性好，方法回收率高，可作為配方奶粉和米粉中維生素D的測(cè)定方法推廣應(yīng)用。在線固相萃取結(jié)合二維色譜的預(yù)處理模式凈化效果好，操作簡(jiǎn)單，也可以為復(fù)雜基質(zhì)中維生素B12、泛酸、生物素等其他低含量維生素的測(cè)定提供一種新的思路。