比濁法測(cè)定硫酸多黏菌素抑制霉菌的條件優(yōu)化

王志新,宏丹,魯雷震,周景波,劉洋,寧亞維,馬愛進(jìn),賈英民

1(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊,050018) 2(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京,100048)

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是指具有抑菌活性的小分子多肽，可以抑制多種病原微生物[1-3]。種類多、抑菌譜廣、抑菌活性高、無污染、無殘留是抗菌肽的顯著優(yōu)勢(shì)[4]?，F(xiàn)今抗菌肽已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)[5]、養(yǎng)殖業(yè)[6, 4, 11-12]、食品工業(yè)[7-10]、醫(yī)藥行業(yè)[13]等領(lǐng)域。近年來，抗菌肽替代抗生素的研究已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，抗菌肽已被廣泛開發(fā)與使用，常見抑制革蘭氏陽性菌的肽有桿菌肽，抑制革蘭氏陰性菌的肽有多黏菌素B、黏菌素等[14]，抑制真菌的肽有沙拉霉素、硫酸多黏菌素等[15]，用于食品保藏劑的有乳鏈菌肽[16-18]，用于飼料添加劑的有硫肽菌素、那西肽等[19]。

食品在加工、包裝和儲(chǔ)運(yùn)過程中與外界環(huán)境接觸，使得食品帶有種類繁多的微生物，其中霉菌生長(zhǎng)力旺盛、抵抗力強(qiáng)，食品中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加速霉菌的繁殖，最終引起食品腐爛變質(zhì)。部分霉菌在侵染食品的過程中還會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，因此，防治霉菌污染已成為食品保藏中的重要研究?jī)?nèi)容。在霉菌污染的防治中，生物防腐劑或抑菌劑已被廣泛開發(fā)與應(yīng)用。龔慶偉[20]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌脂肽Bacillomycin D對(duì)黃曲霉病菌孢子的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.05 g/L，最小致死質(zhì)量濃度為0.2 g/L。韓玉竹等[21]報(bào)道辣椒籽抗菌肽能夠抑制黃曲霉生長(zhǎng)，在最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)下，黃曲霉的萌發(fā)率降至18.51%，濃度達(dá)到4MIC時(shí)能完全抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)。但目前在抗菌肽抑制腐敗霉菌的研究存在一定問題，即測(cè)定方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)不統(tǒng)一，致使測(cè)定結(jié)果可比性差。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的評(píng)價(jià)方法成為抗菌肽研究與開發(fā)的關(guān)鍵。

目前關(guān)于抗菌肽抑制真菌的活性檢測(cè)方法主要有瓊脂擴(kuò)散法[22]、菌絲生長(zhǎng)抑制法[23]和孢子萌發(fā)抑制法[24]。本實(shí)驗(yàn)室前期采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了抗菌肽抑制真菌[15]和細(xì)菌[25]的活性，顯示方法準(zhǔn)確，但所需試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)(一般需要30～34 h)；而采用菌絲生長(zhǎng)抑制法和孢子萌發(fā)抑制法測(cè)定對(duì)真菌的抑菌活性時(shí)容易產(chǎn)生試驗(yàn)誤差。因此，尋找簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速測(cè)定抗菌肽對(duì)真菌抑菌活性的方法尤為重要。目前對(duì)于抗菌肽的測(cè)定一般參照中國(guó)藥典[26]中抗生素的測(cè)定方法，其主要采用微生物檢定法，其中的比濁法是通過建立抗生素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度的線性關(guān)系來測(cè)定抗生素對(duì)細(xì)菌和酵母菌的抑菌活力[26]，很多文獻(xiàn)也有相關(guān)報(bào)道[27-29]。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確快速，但此方法在中國(guó)藥典中并未涉及對(duì)真菌的檢測(cè)。由于真菌具有菌絲，這種測(cè)定方法是否適用于抗菌肽對(duì)真菌的抑菌活性檢測(cè)，還有待于研究。

基于此，本文采用比濁法，以硫酸多黏菌素B和青霉為研究對(duì)象，考察此法是否適合評(píng)價(jià)抗菌肽對(duì)霉菌的抑菌活性；同時(shí)對(duì)影響比濁法測(cè)定的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，建立抗菌肽濃度對(duì)數(shù)值與吸光度的線性關(guān)系，利用線性相關(guān)系數(shù)R2、斜率、截距等優(yōu)化指示菌濃度、抗菌肽濃度、二者比例和兩者反應(yīng)時(shí)間等因素，并進(jìn)一步選用常見的引起食品腐敗的霉菌典型代表——黑曲霉、黃曲霉、總狀毛霉進(jìn)行驗(yàn)證，以期獲得簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)ATCC 10106、黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 16404、黃曲霉(Aspergillusflavus)ATCC 9643、總狀毛霉(Mucorracemosus)ATCC 23314，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 抗菌肽

硫酸多黏菌素 B(polymyxin B)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZSD-A1160全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；EVOLUTION 220紫外分光光度計(jì)，天美科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS-CX31顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；SHZ-A水浴恒溫振蕩器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的配制

將產(chǎn)黃青霉均勻涂布于PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18～24 h，取適量生理鹽水加入培養(yǎng)基表面，用涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕刮動(dòng)，脫脂棉過濾菌絲，獲得孢子懸液，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用生理鹽水對(duì)孢子懸液進(jìn)行稀釋和調(diào)整，備用。

1.3.2 硫酸多黏菌素溶液的配制

選用無菌水配制硫酸多黏菌素，質(zhì)量濃度為0.01～5.0 g/L，備用。

1.3.3 指示菌培養(yǎng)方式的選擇

將1.3.1制備的孢子懸液添加到PDB培養(yǎng)基中，保證兩者的指示菌初始添加濃度相同，選擇靜置與振蕩2種培養(yǎng)方式，每隔2 h采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(OD600)，觀察2種培養(yǎng)方式對(duì)指示菌生長(zhǎng)的影響。

1.3.4 硫酸多黏菌素濃度與吸光度的線性關(guān)系

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度選擇0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度為0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養(yǎng)10 h后觀察其生長(zhǎng)情況，并測(cè)定OD600值。將硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值設(shè)為橫坐標(biāo)，吸光度OD600值設(shè)為縱坐標(biāo)，分析兩者是否成線性關(guān)系。

1.3.5 定量測(cè)定方法的優(yōu)化

1.3.5.1 硫酸多黏菌素濃度的選擇

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度為0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養(yǎng)10 h，觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)定OD600值。

1.3.5.2 指示菌濃度的選擇

選擇產(chǎn)黃青霉?jié)舛葹?1～2)×105、(1～2)×106和(1～2)×107CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度選擇0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，振蕩培養(yǎng)10 h，觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)定OD600值。并進(jìn)一步采用(3～5)×106CFU/mL的指示菌，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5.3 指示菌與硫酸多黏菌素比例的選擇

保證不同比例下硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度為0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)和指示菌終濃度為(1～2)×106CFU/mL，通過調(diào)節(jié)二者的初始濃度，將指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例分別設(shè)為1∶1、4∶1和9∶1，培養(yǎng)10 h后觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)定OD600值的變化。

1.3.5.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

指示菌濃度為(1～2)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度選擇為0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)，指示菌與硫酸多黏菌素比例為4∶1，分別振蕩培養(yǎng)7、8、9、10、11 h，觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)定OD600值。

1.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

不同實(shí)驗(yàn)人員的驗(yàn)證：另外3名實(shí)驗(yàn)人員按照優(yōu)化后的測(cè)定條件進(jìn)行方法穩(wěn)定性的驗(yàn)證。

不同指示菌的驗(yàn)證：選用黑曲霉ATCC 16404、黃曲霉ATCC 9643和總狀毛霉ATCC 23314為指示菌進(jìn)行方法通用性的驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 指示菌培養(yǎng)方式的選擇

霉菌生長(zhǎng)較為緩慢，不同培養(yǎng)方式對(duì)霉菌的生長(zhǎng)具有顯著影響，本試驗(yàn)選擇振蕩與靜置2種培養(yǎng)方式。從圖1可以看出，0～3 h產(chǎn)黃青霉?jié)舛瘸尸F(xiàn)下降趨勢(shì)，初步推斷在加入硫酸多黏菌素后將部分產(chǎn)黃青霉殺死。振蕩培養(yǎng)3 h開始，青霉開始生長(zhǎng)，濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；培養(yǎng)到12 h以后，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況觀察，此時(shí)青霉菌絲生長(zhǎng)明顯，菌絲相互纏繞，影響吸光度的測(cè)定，導(dǎo)致OD下降。靜置培養(yǎng)3 h開始，青霉?jié)舛瘸尸F(xiàn)上升趨勢(shì)，但OD600值相對(duì)于振蕩培養(yǎng)增長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)到15 h以后，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，此時(shí)青霉菌絲生長(zhǎng)明顯，導(dǎo)致OD600值下降。為了節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，提高效率，本試驗(yàn)選擇振蕩培養(yǎng)進(jìn)行抑菌活性的研究。

圖1 靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)的比較

2.2 硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與指示菌吸光度值線性關(guān)系的驗(yàn)證

從圖2看出，硫酸多黏菌素在0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)范圍內(nèi)，比濁法測(cè)定硫酸多黏菌素的濃度對(duì)數(shù)值與吸光度值呈現(xiàn)線性關(guān)系。

圖2 硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度之間的線性關(guān)系

由表1可知，3次重復(fù)試驗(yàn)，斜率截距的相對(duì)偏差均較小，且相關(guān)系數(shù)R2均高于0.99，說明此方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度較高，且重復(fù)性較好。

表1 硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度線性關(guān)系的結(jié)果分析

2.3 硫酸多黏菌素定量測(cè)定方法的優(yōu)化

在試驗(yàn)過程中，硫酸多黏菌素濃度、指示菌濃度、兩者的比例和培養(yǎng)時(shí)間等因素均會(huì)對(duì)試驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)生影響，因此，下一步需要對(duì)以上因素進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最適的定量測(cè)定條件。

2.3.1 硫酸多黏菌素濃度的選擇

采用0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)的硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度進(jìn)行研究，其結(jié)果見圖3和表2。硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度在0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，3次重復(fù)的R2均大于0.99，根據(jù)斜率和截距可知，該試驗(yàn)的精密度和穩(wěn)定性較好。

圖3 硫酸多黏菌素濃度的選擇

表2 不同硫酸多黏菌素濃度結(jié)果分析

2.3.2 青霉?jié)舛鹊倪x擇

根據(jù)實(shí)際情況和表3的結(jié)果可知，培養(yǎng)10 h后，產(chǎn)黃青霉?jié)舛葹?1～2)×105CFU/mL時(shí)，菌體生長(zhǎng)不明顯，不能很好地表征硫酸多黏菌素的抑菌效力，且導(dǎo)致試驗(yàn)誤差大，在一定的硫酸多黏菌素濃度范圍內(nèi)不能呈現(xiàn)線性關(guān)系。青霉?jié)舛葹?1～2)×107CFU/mL時(shí)菌體濃度高，菌體量大，生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)10 h后出現(xiàn)菌絲纏繞現(xiàn)象，影響吸光度值，誤差較大(圖4)。青霉?jié)舛葹?1～2)×106CFU/mL時(shí)，在特定的硫酸多黏菌素濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系且重復(fù)性較好(圖5和表3)。

表3 不同指示菌濃度結(jié)果分析

圖4 產(chǎn)黃青霉?jié)舛葹?1～2)×107 CFU/mL的生長(zhǎng)情況

圖5 產(chǎn)黃青霉?jié)舛葹?1～2)×106 CFU/mL的試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步采用(3～5)×106CFU/mL濃度的青霉進(jìn)行驗(yàn)證，從圖6和表4可以看出，線性關(guān)系良好，根據(jù)斜率和截距得出，青霉?jié)舛葹?1～2)×106和(3～5)×106CFU/mL時(shí)，試驗(yàn)的精密度和穩(wěn)定性都很高，因此，青霉?jié)舛冗x擇(1～5)×106CFU/mL。

圖6 產(chǎn)黃青霉?jié)舛葹?3～5)×106 CFU/mL的試驗(yàn)結(jié)果

表4 產(chǎn)黃青霉?jié)舛?3～5)×106 CFU/mL驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.3 指示菌和硫酸多黏菌素比例的選擇

指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例分別設(shè)為1∶1、4∶1和9∶1，從圖7和表5看出，指示菌與硫酸多黏菌素濃度比例為1∶1和9∶1時(shí)線性相關(guān)差，且比例為1∶1時(shí)，體系中培養(yǎng)基量較少,不能為菌體的生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；比例為9∶1時(shí)，菌體生長(zhǎng)較快，不能很好地表征硫酸多黏菌素的抑菌效力；而當(dāng)兩者比例為4∶1時(shí)，培養(yǎng)基適中，線性相關(guān)性較好，斜率和截距相對(duì)偏差較小，此時(shí)精密度和穩(wěn)定性好，因此本試驗(yàn)選擇指示菌和硫酸多黏菌素的比例為4∶1。

圖7 指示菌和硫酸多黏菌素比例的選擇

表5 指示菌和硫酸多黏菌素不同比例的試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

不同反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果見圖8和表6。培養(yǎng)7和8 h后指示菌菌體量少，結(jié)果誤差較大，硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度線性關(guān)系較低，斜率和截距相對(duì)偏差較大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，11 h時(shí)青霉已長(zhǎng)出菌絲，出現(xiàn)菌絲纏繞現(xiàn)象，測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。而培養(yǎng)時(shí)間為9 h時(shí)，基本還未出現(xiàn)菌絲，且線性相關(guān)性較強(qiáng)(R2>0.99)，根據(jù)斜率和截距可以看出，精密度和穩(wěn)定性也較好，因此，本試驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為9 h。

圖8 指示菌和硫酸多黏菌素反應(yīng)時(shí)間選擇

表6 指示菌和硫酸多黏菌素反應(yīng)不同時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用優(yōu)化后的條件：指示菌濃度(1～5)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)，二者比例4∶1，反應(yīng)時(shí)間9 h，進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和通用性。

通過不同人員的操作研究方法的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9和表7。結(jié)果顯示，硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.99)，從斜率和截距可以看出，本實(shí)驗(yàn)的精密度和穩(wěn)定性較好。

圖9 硫酸多黏菌素抑制P.chrysogenum ATCC 10106的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表7 硫酸多黏菌素抑制P.chrysogenum ATCC 10106的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

進(jìn)一步選用黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉為指示菌，利用優(yōu)化后的條件進(jìn)行方法通用性的驗(yàn)證。從圖10、11、12和表8、9、10看出，硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度成線性關(guān)系，斜率和截距相對(duì)偏差較小，說明試驗(yàn)精密度高，穩(wěn)定性好。

圖10 硫酸多黏菌素抑制A.niger ATCC 16404的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表8 硫酸多黏菌素抑制A.niger ATCC 16404的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖11 硫酸多黏菌素抑制A.flavus ATCC 9643的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表9 硫酸多黏菌素抑制A.flavus ATCC 9643的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖12 硫酸多黏菌素抑制M.racemosus ATCC 23314的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表10 硫酸多黏菌素抑制M.racemosus ATCC 23314的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過上述驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步說明，利用比濁法研究硫酸多黏菌素對(duì)霉菌的定量測(cè)定，該方法具有廣泛適用性，且測(cè)定簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速。

3 結(jié)論

本研究選用比濁法，通過優(yōu)化指示菌濃度、硫酸多黏菌素濃度、二者的比例以及反應(yīng)時(shí)間等因素，建立了硫酸多黏菌素抑制霉菌的定量測(cè)定方法，其最佳條件為：指示菌濃度(1～5)×106CFU/mL，硫酸多黏菌素質(zhì)量濃度0.01～2.5 g/L(終質(zhì)量濃度0.01～0.5 g/L)，二者比例4∶1，反應(yīng)時(shí)間9 h，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，硫酸多黏菌素濃度對(duì)數(shù)值與吸光度之間呈現(xiàn)線性關(guān)系，選用黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉作為指示菌進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，比濁法的重復(fù)性高。

本實(shí)驗(yàn)室前期采用瓊脂擴(kuò)散法[15]研究多黏菌素抑制霉菌的測(cè)定方法，顯示其進(jìn)行抑菌活力測(cè)定時(shí)需要30～34 h(4 ℃冰箱預(yù)擴(kuò)散6～10 h，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h)，而本研究采用的比濁法僅需要9 h即可完成測(cè)定，時(shí)間縮短了21～25 h，解決了瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗菌肽效價(jià)時(shí)間長(zhǎng)的問題。由此可以表明，比濁法測(cè)定硫酸多黏菌素抑制霉菌活性的方法具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)。