精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復(fù)蘇效果的影響

梅鳳琦 甄錦壯 麥福勁 何正枝

【摘要】 目的：探討精液冷凍前優(yōu)化處理方式對不同精子活力的精子冷凍復(fù)蘇效果的影響。方法：選取符合條件的標(biāo)本50份，每份標(biāo)本等分4份，以原液作為對照（A組），分別采用三種不同方式[洗滌法（B組）、上游法（C組）和密度梯度離心法（D組）]進(jìn)行處理，再行精子冷凍復(fù)蘇。比較不同精子活力標(biāo)本在不同優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率。結(jié)果：精子冷凍復(fù)蘇率由高至低排序?yàn)锳組>C組>D組>B組。B組和D組精子冷凍復(fù)蘇率均顯著低于A組（P<0.05），C組與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。低活力（前向運(yùn)動精子PR≤32%）標(biāo)本中，各處理方式精子冷凍復(fù)蘇率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。正?；盍Γㄇ跋蜻\(yùn)動精子PR>32%）標(biāo)本中，B組精子冷凍復(fù)蘇率顯著低于其余三組（P<0.05），A組、C組、D組三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復(fù)蘇率有影響，實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)精液的質(zhì)量選擇合適的精液冷凍前優(yōu)化處理方式。

【關(guān)鍵詞】 精液冷凍 精液優(yōu)化處理 精子冷凍復(fù)蘇率

Effect of Spermatozoa Selection before Freezing on Recovery Rate of Human Frozen Spermatozoa/MEI Fengqi， ZHEN Jinzhuang， MAI Fujin， HE Zhengzhi. //Medical Innovation of China， 2020， 17（04）： -116

[Abstract] Objective： To investigate the effect of spermatozoa selection before freezing on the recovery rate of human frozen spermatozoa of different sperm motility. Method： A total of 50 specimens that meet the requirements were selected. Each sample was divided into 4 equal parts， and the stock solution was used as a control （group A）. Before sperm freezing and recovery， the spermatozoa selection was carried out in three different ways [washing （group B）， swimming-up （group C） and density-gradient centrifugation（group D）]. The recovery rate of frozen spermatozoa of different sperm motility with different treatment was compared. Result： The sperm recovery rate was ranked from high to low in group A > group C > group D > group B. The sperm recovery rate of group B and group D were significantly lower than those of group A （P<0.05）， and there was no significant difference between group C and group A （P>0.05）. In low vitality （PR≤32%）， there was no significant difference in the sperm recovery rates between the treatments （P>0.05）. In normal vitality （PR>32%）， the sperm recovery rate in group B was significantly lower than those of the other three groups （P<0.05）， and there was no significant difference among group A， group C， and group D （P>0.05）. Conclusion： The spermatozoa selection before freezing has an effect on the recovery rate of frozen spermatozoa.In actual work， the appropriate semen pre-freezing treatment should be selected according to the quality of semen.

[Key words] Frozen spermatozoa Spermatozoa selection Recovery rate of frozen spermatozoa

First-authors address： Shunde Women and Childrens Hospital of Guangdong Medical University （Maternal & Child Health Hospital of Shunde Foshan）， Foshan 528300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.04.028

自精保存作為人類輔助生殖技術(shù)（ART）中一個重要組成部分，為男性患者進(jìn)行ART前提供了精子解決方案[1]。常規(guī)精子冷凍保存技術(shù)是采用精液原液，但國內(nèi)生殖中心的冷凍保存空間日漸緊張[2]，繼續(xù)使用精液原液作為自精保存將占用更多的空間。精液經(jīng)過優(yōu)化處理后，可去除大部分非精子物質(zhì)，收集活力與形態(tài)更好的精子[3]，同時減少了體積，可節(jié)省冷凍空間。本文主要探討精液冷凍前優(yōu)化處理方式對精子冷凍復(fù)蘇的影響，特別是對不同活力精子的影響，旨為精液冷凍前選擇合適的優(yōu)化處理方式提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月-2019年7月在本院生殖中心就診，進(jìn)入ART技術(shù)治療的男性患者精液標(biāo)本。所有患者均進(jìn)行以下檢查：精液常規(guī)，乙肝、丙肝、獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）病毒、梅毒螺旋體等感染項目檢查。根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》5版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液分析[4]，將液化正常，精液量≥2.0 mL，精子濃度為（70～200）×106/mL，正常形態(tài)≥4%的標(biāo)本共50份納入研究。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 丹麥ORIGIO SAGE Quinns試劑，ART-1006為精子洗滌培養(yǎng)液，ART-2024為梯度離心培養(yǎng)液，ART-8022為精子冷凍保護(hù)試劑。

1.2.2 儀器 生物顯微鏡（奧林巴斯），普通離心機(jī)（北京白洋），Makler精子計數(shù)板（以色列），培養(yǎng)箱（美國Thermo）。

1.3 方法

1.3.1 精液標(biāo)本收集 所有研究對象均禁欲2～7 d，在專用取精室內(nèi)以手淫方式取精，并全部收集于無菌取精杯內(nèi)，取出的精液標(biāo)本放置于37 ℃水浴箱內(nèi)液化。

1.3.2 精液常規(guī)分析 精液標(biāo)本完全液化后，按WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》5版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液分析，包括精液量、精子濃度、精子活力、正常形態(tài)精子百分比等。各處理組冷凍前和復(fù)蘇后按同樣方法進(jìn)行分析。其中前向運(yùn)動精子（PR）≤32%為低活力，PR>32%為正?；盍Α?/p>

1.3.3 精子優(yōu)化處理方法 每份精液標(biāo)本充分混勻后，分別取0.5 mL，以原液作為對照，另外用三種不同方法（洗滌法、上游法、密度梯度離心法）進(jìn)行冷凍前優(yōu)化處理，共四組。

1.3.3.1 原液（A組） 標(biāo)本不經(jīng)處理直接進(jìn)入冷凍步驟。

1.3.3.2 洗滌法（B組） 標(biāo)本加入ART-1006混勻后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調(diào)至0.5 mL后計數(shù)備用。

1.3.3.3 上游法（C組） 在標(biāo)本上方，緩慢加入1.2倍的ART-1006，傾斜45°并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)上游30 min。上游后吸取上層液，加入ART-1006混勻后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調(diào)至0.5 mL后計數(shù)備用。

1.3.3.4 密度梯度離心法（D組） 在無菌錐形離心管中，用ART-2024制備密度梯度液，下層為80%PureCeption，上層為40%PureCeption。使用

1︰1︰1的體積比，將標(biāo)本加于梯度液上層。500 g離心15 min，離心后棄上清，保留沉淀物，加入ART-1006試劑后，300 g離心6 min，離心后棄上清，用ART-1006重懸沉淀物，調(diào)至0.5 mL后計數(shù)備用。

1.3.4 精子冷凍與復(fù)蘇

1.3.4.1 精子冷凍 用ART-8022按1︰1體積比例添加到各組精子懸液中。將混合物置于4 ℃冰箱15 min，再懸掛于液氮上方10 cm處15 min，最后投入液氮中保存。

1.3.4.2 精子復(fù)蘇 冷凍一周后，將精子混合物從液氮中取出，立即置于37 ℃水浴箱里10 min。充分混勻后進(jìn)行精液分析。

1.3.5 精子冷凍復(fù)蘇效果的評價標(biāo)準(zhǔn) 采用精子冷凍復(fù)蘇率作為精子冷凍復(fù)蘇效果的評價標(biāo)準(zhǔn)，公式如下：精子冷凍復(fù)蘇率=（復(fù)蘇后PR百分率）/（冷凍前PR百分率）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用Friedman檢驗(yàn)，兩兩比較采用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同冷凍前優(yōu)化處理方法的復(fù)蘇后PR百分率比較 50份標(biāo)本低活力21份，正?；盍?9份。不同活力的標(biāo)本，經(jīng)C組處理，其冷凍復(fù)蘇后的PR百分率顯著高于A組、B組、D組（P<0.05），見表1。

2.2 不同冷凍前精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率比較

2.2.1 50份經(jīng)各精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率比較 各精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率由高至低的排序?yàn)锳組[（64.36±21.51）%]>C組[（61.93±15.09）%]>D組[（55.37±14.63）%]>B組[（50.93±17.74）%]。C組比A稍低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;C組與B組和D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B組與A組、C組和D組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。D組與A組、B組和C組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.2 21份低活動力標(biāo)本經(jīng)各種精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率比較 各精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率由高至低的排序?yàn)镃組[（63.54±15.74）%]>A組[（62.68±22.07）%]>B組[（54.03±18.73）%]>D組[（52.98±13.93）%]，各組精子冷凍復(fù)蘇率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.119）。

2.2.3 29份正?；盍?biāo)本經(jīng)各種精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率比較 各精液優(yōu)化方法處理后的精子冷凍復(fù)蘇率由高至低的排序?yàn)锳組[（65.58±21.40）%]>C組[（60.76±14.78）%]>D組[（57.10±15.12）%]>B組[（48.68±16.97）%]。B組顯著低于A組與C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;B組與D組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;A組、C組、D組三種優(yōu)化處理方法精子冷凍復(fù)蘇率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

精子在冷凍復(fù)蘇過程會有一定的損傷，其機(jī)制在于細(xì)胞內(nèi)形成冰晶[5]、產(chǎn)生活性氧（ROS）等[6]，導(dǎo)致復(fù)蘇后精子活力下降[7]。有研究提示，精子參數(shù)對ART技術(shù)結(jié)局有一定影響[8-10]。所以提高復(fù)蘇后精子活力與冷凍復(fù)蘇率成為關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示，洗滌組的精子冷凍復(fù)蘇率較低。洗滌法采用離心方式去除精漿。離心作為ATR技術(shù)中精液處理的常規(guī)操作，但離心過程會增加ROS，史瀟等[11]進(jìn)一步證實(shí)離心時間對精子活力有影響。精漿內(nèi)包含部分抗氧化物質(zhì)[12]，去除精漿可能讓精子抗ROS能力減弱，導(dǎo)致精子冷凍復(fù)蘇率下降。除非精液標(biāo)本精子濃度很低，則不建議采用洗滌法作為冷凍前優(yōu)化處理的首選方法。

近年來，很多學(xué)者均嘗試在精子冷凍前添加各種物質(zhì)，如維生素E[13]、番茄紅素[14]、異檸檬酸[15]等，用來提高復(fù)蘇后精子活力。雖然這些方法能有效提高精子復(fù)蘇后的活力，但目前尚無充分證據(jù)證明，冷凍前添加其他物質(zhì)，對ART技術(shù)中后續(xù)的胚胎發(fā)育是否有影響[16]。所以在實(shí)際工作中，添加其他保護(hù)劑來提高復(fù)蘇后精子活力的應(yīng)用相對有限。本研究結(jié)果顯示，上游法處理后的標(biāo)本在復(fù)蘇后精子活力最高，同時上游組的精子冷凍復(fù)蘇率與原液組的相近，特別是低活力（PR≤32%）時，上游法的精子冷凍復(fù)蘇率比原液組的稍高。這與Petyim等[17]研究結(jié)果相似。上游法在各精子優(yōu)化處理方法中，對精液標(biāo)本的干預(yù)較少，能篩選出活力較好的精子，并大幅降低死精子的比例。提示自精保存中，特別是低活力標(biāo)本，采用上游法進(jìn)行冷凍前優(yōu)化處理，可提高復(fù)蘇后的精子活力，并與精液原液冷凍復(fù)蘇有相近的效果。但上游法也有不足，其所收集的精子總數(shù)相比其他方法的欠理想[18]。由于ART技術(shù)中，如宮腔內(nèi)人工授精（IUI）和體外受精（IVF）技術(shù)，對精子總數(shù)有一定要求[19-20]，所以對于低活力且低濃度的標(biāo)本不建議采用上游法進(jìn)行冷凍前預(yù)處理，否則會造成復(fù)蘇后的活動精子總數(shù)不足以進(jìn)行IUI/IVF技術(shù)。

密度梯度離心法能收集形態(tài)正常和活力較好的精子。鄭春毅等[21]認(rèn)為，密度梯度離心法更適用于嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥或精子DNA碎片率較高的標(biāo)本。本研究中，正?；盍Φ臉?biāo)本使用上游法或密度梯度離心法，其精子冷凍復(fù)蘇率與原液比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示活力正常、低濃度標(biāo)本可通過密度梯度離心法收集更多的活動精子，并與原液冷凍復(fù)蘇有相近的效果。

綜上，精子冷凍前的優(yōu)化處理方式對精子冷凍復(fù)蘇效果有一定影響。為取得與精液原液相近的精子冷凍復(fù)蘇效果，同時減少占用冷凍保存空間，可選擇上游法進(jìn)行冷凍前的精液處理。對于低活力且低濃度的精液標(biāo)本，則不建議采用上游法。對于活動力正常、低濃度精液標(biāo)本，還可使用密度梯度離心法收集更多的活動精子。實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)精液質(zhì)量來選擇合適的方法進(jìn)行冷凍前預(yù)處理。

參考文獻(xiàn)

[1]馬春杰，莊嘉明，鄧順美，等.廣東人類精子庫生殖保險及臨床應(yīng)用13年回顧性分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2017，38（5）：748-750.

[2]全松，黃國寧，孫海翔，等.冷凍胚胎保存時限的中國專家共識[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2018，27（10）：925-931.

[3]李明國，張斌，李亞瑋，等.多次精液優(yōu)化技術(shù)的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28（9）：114-116.

[4]谷翊群，陳振文，盧文紅，等，譯.WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊[M].5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[5]魏哲文，楊竣，王濤，等.人類精子冷凍保存技術(shù)的研究進(jìn)展[J].臨床泌尿外科雜志，2017，32（12）：923-925.

[6] Amidi F，Pazhohan A，Shabani Nashtaei M，et al.The role of antioxidants in sperm freezing：a review[J].Cell and Tissue Banking，2016，17（4）：745-756.

[7] Kopeika J，Thornhill A，Khalaf Y.The effect of cryopreservation on the genome of gametes and embryos：principles of cryobiology and critical appraisal of the evidence[J].Human Reproduction Update，2014，21（2）：209-227.

[8]陳紹威，王明勇，付莉，等.精液處理前、后精子3項對IVT-ET結(jié)局的相關(guān)性分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（32）：4526-4528，4532.

[9] Li B，Ma Y，Huang J，et al.Probing the Effect of Human Normal Sperm Morphology Rate on Cycle Outcomes and Assisted Reproductive Methods Selection[J].PLoS One，2014，9（11）：e113392.

[10]邱峰龍，左陽花，馮播，等.不同精液優(yōu)化處理方式前后精子質(zhì)量參數(shù)的變化及對IVF-ET結(jié)局的影響[J].中國臨床研究，2017.30（1）：109-112.

[11]史瀟，王婷，周瑤，等.體外操作對人精子運(yùn)動參數(shù)及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的影響[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2016，35（5）：369-371.

[12] Agarwal A D，Durairajanayagam D，Plessis S.Utility of antioxidants during assisted reproductive techniques：an evidence based review[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2014，12：112.

[13]韓鵬，王尚乾，唐敏，等.維生素E對人精子凍融氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J]. 中華男科學(xué)雜志，2014，20（2）：147-151.

[14]梁作文，郭凱敏，戴小凡，等.番茄紅素對人精子冷凍損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中華男科學(xué)雜志，2015，21（6）：521-526.

[15]趙凱，陳偉，徐愛明，等.異檸檬酸在精子凍融中保護(hù)作用的初探[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，37（2）：165-168.

[16] Agarwal A，Majzoub A.Role of Antioxidants in Assisted Reproductive Techniques[J].The World Journal of Mens Health，2017，35（2）：77-93.

[17] Petyim S，Neungton C，Thanaboonyawat I，et al.Sperm preparation before freezing improves sperm motility and reduces apoptosis in post-freezing-thawing sperm compared with post-thawing sperm preparation[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics，2014，31（12）：1673-1680.

[18]譚玉梅，宋革，祝曉麗，等.密度梯度離心聯(lián)合上游法的精液處理在供精體外受精胚胎移植中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（22）：56-58.

[19]劉文靜，李文濤，張榮玲，等.宮腔內(nèi)人工授精臨床妊娠率的影響因素分析[J].中華男科學(xué)雜志，2015，21（11）：992-996.

[20]中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會.人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識（2016）[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26（1）：1-8.

[21]鄭毅春，梁嘉穎，杜鵬，等.精液保存和優(yōu)化處理方法對精子DNA完整性的影響[J].中華男科學(xué)雜志，2016，22（5）：432-436.

（收稿日期：2019-11-11） （本文編輯：程旭然）