CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達及意義

趙若晗　史嘉翊　劉馨璥　宋潔

【摘要】 目的：研究CDK1、CENPT和P53在乳腺癌中的表達情況，探討基因表達與乳腺癌患者生存率及病理階段分型的關(guān)聯(lián)性和調(diào)控關(guān)系。方法：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌和正常樣本中的表達與總體生存率，乳腺癌患者基因表達與病理分期影響，CENPT與CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53的相關(guān)性分析，UALCAN數(shù)據(jù)庫驗證結(jié)果。敲減CENPT后，半定量PCR檢測CDK1、BAX、BCL2、CASP3、P53在MCF7細胞系中的表達。結(jié)果：CDK1、CENPT在乳腺癌及正常組織表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;CDK1、BCL2表達與不同病理分期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;P53不同表達乳腺癌患者總體生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;乳腺癌MCF7細胞系敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達量均減少（P<0.05）。結(jié)論：與正常組織比較，在乳腺癌中CENPT表達水平降低，CDK1表達水平升高;P53表達水平與生存率成反比。乳腺癌中CENPT、P53、Bax、CASP3信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡參與乳腺癌的進展。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 生物信息學 CENPT CDK1

Effect and Expression of CENPT， CDK1 and P53 in Breast Cancer/ZHAO Ruohan， SHI Jiayi， LIU Xinjing， SONG Jie. //Medical Innovation of China， 2020， 17（09）： 0-031

[Abstract] Objective： To discuss the expression of CENPT， CDK1 and P53 in breast cancer， to explore the correlation and the regulatory relationship between gene expression and survival rate and pathological stage classification of breast cancer patients. Method： GEPIA database was used to analyze the expression and overall survival rate of breast cancer and normal samples， the pathological stage and gene expression in breast cancer patients， the correlation between CENPT and CDK1， BAX， BCL2， CASP3， P53， and the validation results of UALCAN database. RT-PCR was used to detect the expression of CDK1， BAX， BCL2， CASP3 and P53 in MCF7 cell lines after knocking down CENPT. Result： The expression of CDK1 and CENPT in breast cancer and normal tissues were significantly different （P<0.05）. The expression of CDK1 and BCL2 was significantly different from those of different pathological stages （P<0.05）. The different expression of P53 was significantly different in the overall survival rate of breast cancer patients （P<0.05）. The expression of P53， BAX and CASP3 in breast cancer MCF7 cell lines decreased after CENPT knockout （P<0.05）. Conclusion： Compared with normal tissues， the expression level of CENPT in breast cancer is lower and the expression level of CDK1 is higher， and the expression level of P53 is inversely proportional to the survival rate. CENPT， P53， Bax， CASP3 signaling pathway regulates apoptosis in breast cancer and participates in the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer Bioinformatics CDK1 CENPT

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.09.007

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國發(fā)病率為16.8%，且每年3%～4%遞增[1]，文獻[2]證實細胞周期調(diào)控分子參與腫瘤進程。Cyclin dependent kinase 1（CDK1）通過Centromere specafic proteins T（CENPT）調(diào)控動粒核心蛋白網(wǎng)絡[3-4]。異常CDK1調(diào)控使細胞周期紊亂導致腫瘤發(fā)生[3]。磷酸化P53（tumor protein 53）誘導P21轉(zhuǎn)錄抑制CDK1活性。P53激活BCL2-Associated X（BAX）通路通過Caspase 3誘導凋亡[5]。CDK1、CENPT、P53與乳腺癌相關(guān)性未見報道，因此本文以三者為切入點探討它們在乳腺癌中的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌MCF-7細胞系由哈爾濱工業(yè)大學癌生物學實驗室惠贈，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、PBS、RNA提取試劑、Taq Mix、引物均購于生工生物有限公司，siRNA購自銳博生物有限公司。

1.2 在線數(shù)據(jù)庫使用 GEPIA（gepia.cancer-pku.cn）進生物信息學處理。對乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3表達與患者病理分級、生存率及CENPT相關(guān)性數(shù)據(jù)進行分析，并用UALCAN（ualcan.path.uab.edul）驗證。

1.3 細胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7，Count star計數(shù)5次平均值。細胞80%時按說明書轉(zhuǎn)染。

1.4 RT-PCR 檢測基因的表達 試劑盒提取cDNA，擴增程序95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s）×30次;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。凝膠電泳分析條帶。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。One-way ANOVA分析與乳腺癌患者病理分期相關(guān)性，Log-rank時序檢驗分析乳腺癌患者總體生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌與正常樣本中基因表達情況 GEPIA分析1 085例乳腺癌和291例正常樣本log2（TPM+1）對數(shù)比差異見圖1A。CENPT、CDK1差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000 031、0.000 004），CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3在乳腺癌中均高表達，CENPT與其他表達趨勢相反。UALCAN趨勢一致見圖1B。

2.2 乳腺癌患者病理分期與表達分析 乳腺癌樣本F分布>3，log2（TPM+1）對數(shù)假設(shè)檢驗P值單向病理階段差異分析，Pr（>F）<0.05為顯著，見圖2。CDK1、BCL2表達對不同病理分期患者有統(tǒng)計學意義（F=5.17、3.2，P=0.000、0.012 6），BCL2表達隨病理分期進展而降低，CDK1一期到二期上升。

2.3 乳腺癌患者總體生存率時序檢驗與表達分

析 GEPIA分析乳腺癌患者基因表達與生存率，Cox PH計算危險比見圖3A、3B。同一時間低表達P53（HR=1.4，P=0.038）存活人數(shù)高于高表達，隨著時間推進差異更明顯。其他相關(guān)基因表達水平對乳腺癌患者的總體生存率影響均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與UALCAN趨勢一致見圖3C。P53高表達人群總體生存率危險比最高生存力最低，依次為CDK1、CASP3、BCL2、CENPT、BAX。

2.4 CENPT與CDK1、P53、BAX、BCL2、CASP3相關(guān)性分析 GEPIA分析基因表達相關(guān)性，PEARSON對數(shù)可視化，|R|=1相關(guān)性最強。CENPT與CASP3（P=5.2×10-54，R=-0.4）、CDK1（P=1.8×10-27，R=-0.29）、P53（P=8.5×10-21，

R=-0.25）相關(guān)性較強，與BCL2（P=3.7×10-13，R=-0.19）、

BAX（P=3.3×10-9，R=-0.16）較弱見圖4A。半定量PCR分析，CENPT敲減前為（0.143±0.008），敲減后為（0.011±0.001），敲減前后比較差異有統(tǒng)計學意義（t=15.900，P=0.000）;MCF7中P53、CASP3、BAX分別由（0.053±0.003）、（0.068±0.004）、（0.043±0.002）減少至（0.009±0.001）、（0.028±0.002）、（0.022±0.001），差異均有統(tǒng)計學意義（t=14.099、9.373、7.623，P=0.000、0.002、0.002）;CDK1、BCL2表達變化比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）見圖4B、C。

3 討論

細胞增殖與細胞凋亡與腫瘤密切相關(guān)。遺傳物質(zhì)的不平衡是腫瘤進展的重要特征。染色體不穩(wěn)定性產(chǎn)生主要涉及染色體的著絲粒、監(jiān)測點等原因[6]。因此，著絲粒結(jié)構(gòu)和功能的研究是探討腫瘤細胞周期、細胞凋亡的切入點[7]。

本文分析探討低表達CENPT與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系。數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌和正常樣本CENPT、CDK1、BAX、BCL2、P53、CASP3表達，CENPT在

乳腺癌表達水平低于正常樣本，與其他相反，其中CDK1最顯著。CENPT與CASP3、CDK1、P53的相關(guān)性比BCL2、BAX強。P53對患者的總體生存率影響差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），成反比。敲低CENPT后P53、CASP3、BAL2表達量均減少（P<0.05），CDK1、BCL2差異均不顯著（P>0.05）。CENPT調(diào)控CDK1周期動粒蛋白網(wǎng)絡系統(tǒng)。雖然敲低CENPT后CDK1在轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯，但可能磷酸化的CDK1會引發(fā)細胞周期紊亂導致腫瘤的發(fā)生，同時P53可被CDK1-Cyclin復合物磷酸化誘導P21轉(zhuǎn)錄，P21抑制CDK1活性[8]，導致腫瘤發(fā)生。敲減CENPT后P53、BAX、CASP3表達量均減少，可能因為細胞凋亡是由基因控制細胞的主動自主有序死亡，涉及一系列基因的激活、表達及調(diào)控作用[9-10]。P53異常抑制抗凋亡因子BCL2，且BAX被P53轉(zhuǎn)錄激活導致P53成功誘導凋亡[11-12]。凋亡小體前提活化胱天蛋白酶家族CASP3參與凋亡執(zhí)行、降解多種底物導致，E2F誘導BCL2促凋亡蛋白表達，P53突變功能喪失，凋亡小體活化，BAX突變失活BCL2表達失調(diào)[13-15]。CASP3能被P53及外界刺激細胞信號活化，釋放BAX等促凋亡蛋白[16]，增強癌細胞控凋亡途徑。

綜上所述，乳腺癌中CENPT表達下調(diào)抑制P53，從而抑制BAX、CASP3凋亡通路參與乳腺癌進展。CENPT是否抑制P53下調(diào)P21、激活CDK1活性、調(diào)節(jié)細胞周期分子機制還需進一步研究。

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（收稿日期：2019-10-30） （本文編輯：程旭然）

*基金項目：黑龍江省省屬高等學校基本科研業(yè)務費項目（2018-kyywfmy-0030）;牡丹江醫(yī)學院研究生創(chuàng)新基金項目（2018YJSCX-33MY）