黃芪對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的探究*

楊麗 胡淑芳

【摘要】 目的：觀察不同劑量黃芪對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎?。―N）大鼠腎臟保護作用。方法：選擇50只健康雌性大鼠，隨機選取10只作為正常對照組，然后將剩余40只大鼠用STZ誘導(dǎo)為糖尿病模型，并將其平均分為糖尿病組，黃芪低、中、高劑量組（腹腔分別注射5、15、30 g/kg）。干預(yù)12周末檢測各組大鼠腎臟AngⅡ、ET-1含量，TGF-β1及PKC表達水平，大鼠尿液、血清及腎皮質(zhì)中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量及血清、腎皮質(zhì)中腎皮質(zhì)丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：與正常組相比，糖尿病組MDA及8-OHdG含量與AngⅡ、ET-1、TGF-β1及PKC水平均較高（P<0.05）;與糖尿病組比較，黃芪各劑量組MDA、8-OHdG含量及AngⅡ、ET-1、TGF-β1及PKC水平均較低（P<0.05），其中以高劑量組改善最為明顯（P<0.05）。結(jié)論：黃芪具有明顯腎臟保護作用，可減輕糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷程度，且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 黃芪 糖尿病腎病 氧化應(yīng)激 腎皮質(zhì)丙二醛 8-羥基脫氧鳥苷

[Abstract] Objective： To investigate the protective value of Astragalus Membranaceus in the kidneys of diabetic rats induced by streptozotocin. Method： Totally 50 healthy female rats were enrolled， from which 10 rats were randomly selected as normal control group. Then the rest rats were induced to diabetic rat models by injections of streptozotocin （STZ）， and the successful models were divided randomly into four groups： the diabetes mellitus group， the low dosage Astragalus Membranceus group， the middle dosage Astragalus Membranceus group and the high dosage Astragalus Membranceus group. After 12 weeks of intervention， the biochemical test was used to measure the levels of TGF-β1， PKC， AngⅡ and ET-1. Other tests were done to measure the activity of superoxide dismutase the content of malondialdehyde （MDA） and 8-hydroxy-deoxyguanosine （8-OHdG） in the renal cortex. Result： The levels of TGF-β1， PKC， Ang Ⅱ， ET-1， MDA and 8-OHdG in the diabetes mellitus group were higher than those in the control group （P<0.05）. And the levels of TGF-β1， PKC， Ang Ⅱ， ET-1， MDA and 8-OHdG in the Astragalus Membranceus treatment groups were lower than those in the diabetes mellitus group （P<0.05）. The Astragalus Membranceus treatment high dose group improved most obviously than other groups （P<0.05）. Conclusion： The traditional Chinese herbal medicine Astragalus Membranceus have a protective value in the kidneys of diabetic， even inhibit the oxidative stress in the kidneys of diabetic rats with an obvious dose-effect relationship.

[Key words] Astragalus Membranceus Diabetic nephropathy Oxidation stress Malondialdehyde 8-hydroxy-deoxyguanosine

First-authors address： Hankou Hospital of Wuhan City， Wuhan 430012， China

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病疾病慢性進展的最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一，最終導(dǎo)致慢性腎功能衰竭，大多數(shù)患者因治療無效而死亡[1]。其中氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生及發(fā)展中起著決定性作用[2]，故目前治療手段多數(shù)以抗氧化為主。研究表明，黃芪可明顯提高過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性，抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成[3]。本研究旨在用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)DN大鼠模型，探討分別用不同劑量的黃芪對大鼠腎功能保護作用及抗氧化應(yīng)激性影響，從而指導(dǎo)我們用中成藥物治療DN中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇50只體質(zhì)量約250 g且健康的雌性大鼠，由筆者所在醫(yī)院動物實驗室提供。

1.2 藥物及試劑

黃芪顆粒（生產(chǎn)批號：1203011，規(guī)格：1 g/包，由生泰爾生物科技集團有限公司提供）。STZ由美國Sigma公司提供;腎皮質(zhì)丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）酶免試劑盒、糖化血紅蛋白酶免試劑盒（上海研謹生物科技有限公司）;血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、人內(nèi)皮素-1（ET-1）放射免疫試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）;轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、蛋白激酶C（PKC）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司）。

1.3 DN模型、分組及給藥

50只中大鼠中隨機選擇其中10只作為對照組，然后切除剩余40只大鼠的左腎后禁食12 h后給予STZ 50 μg/g腹腔注射，給藥72 h后若檢測大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L表明建模成功[4]。將建模完成的40只大鼠平均分成四組，即糖尿病組，黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組;正常對照組及糖尿病組僅腹腔注射等滲的生理鹽水，黃芪低、中、高劑量組分別腹腔注射黃芪5、15、30 g/kg，1次/d，連續(xù)12周。

1.4 標本采集及處理

第12周腹腔藥物注射結(jié)束后，分別采集各組大鼠24 h 尿液、禁食12 h后在麻醉抽取靜脈血液，離心后將血清標本保存于-20 ℃冰箱內(nèi)，完善各項生化指標的檢測。摘取大鼠雙側(cè)腎臟，取其右側(cè)腎臟腎皮質(zhì)用于測定MDA、8-OHdG及各項氧化應(yīng)激指標。

1.5 指標檢測方法

腎臟AngⅡ、ET-1含量采用放射免疫法測定，TGF-β1及PKC表達采用免疫組織化學(xué)染色法檢測，MDA與8-OHdG的測定分別采用硫代巴比妥酸法及酶聯(lián)免疫法。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平

與正常組比較，糖尿病組及黃芪各治療組AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平均較高（P<0.05）;與糖尿病組比較，黃芪各治療組AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平均較低（P<0.05）。與黃芪低劑量組相比，黃芪中、高劑量組ET-1、PKC及TGF-β1及黃芪高劑量組AngⅡ水平較低（P<0.05）;而與黃芪中劑量組比較，黃芪高劑量組ET-1、TGF-β1水平較低（P<0.05），見表1。

2.2 大鼠MDA和8-OHdG水平

與正常組比較，糖尿病組及黃芪各治療組MDA及8-OHdG水平顯著較高（P<0.01）。與糖尿病組比較，黃芪各治療組MDA和8-OHdG水平均較低（P<0.05）。與黃芪低劑量組比較，除外黃芪中劑量組腎皮質(zhì)MDA水平外，余黃芪中、高劑量組MDA、8-OHdG水平均較低（P<0.05）;與黃芪中劑量組比較，黃芪高劑量組MDA和8-OHdG水平較低（P<0.05），見表2。

3 討論

DN在中醫(yī)領(lǐng)域歸為水腫、消渴等范疇，而中成藥黃芪具有利水消腫、補氣升陽、活血化瘀，滋陰補腎，補氣利水。研究證實，黃芪可利于糖尿病患者糖原合成及降低胰島素抵抗，改善胰島素的敏感性，使機體血糖維持穩(wěn)定[5]。范穎等[6]通過對糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激作用的研究表明黃芪具有抗氧化損傷、控制血糖、增強免疫耐受等多種藥理作用。

最近研究觀點認為高糖狀態(tài)時氧化應(yīng)激作用在DN進展中發(fā)揮重要作用。當(dāng)腎組織氧化應(yīng)激時，過多的氧自由基生成，與細胞膜磷脂不可逆性結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物儲積。MDA屬于脂質(zhì)過氧化物之一，當(dāng)腎組織氧化應(yīng)激損傷時，機體MDA水平升高。8-OHdG作為DNA氧化損傷產(chǎn)物在DN的發(fā)病機制中起到重要作用。8-OHdG不能單獨通過細胞內(nèi)外的非DNA氧化損傷產(chǎn)生，且在尿中不受飲食及炎癥因素干擾，故測定24 h尿8-OH dG含量可以作為觀察DN的生化指標。張霞等[7]通過對入組的68名2型糖尿病患者研究發(fā)現(xiàn)，8-OHdG水平與DN病變程度呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致。

Neuhofer等[8]研究表明，生物活性肽ET-1具有縮血管作用，促進腎小球內(nèi)皮細胞增生，有利于細胞外基質(zhì)的生成。高潔等[9]闡明生長因子TGF-β1與糖尿病腎病發(fā)病的發(fā)生發(fā)展呈密切相關(guān)，促進腎臟上皮細胞高度表達，并抑制其凋亡。TGF-β1與ET-1相互促進各自的基因表達上調(diào)，形成正反饋作用，最終兩者過度表達致腎臟嚴重受損[10]。本實驗結(jié)果示糖尿病組及各黃芪治療組AngⅡ、ET-1及PKC、TGF-β1水平明顯增加，腹腔注射黃芪后腎組織ET-1及TGF-β1水平下降，提示黃芪可以改善腎組織免受過度表達的ET-1及TGF-β1的破壞作用。PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以使TGF-β1表達上調(diào)，最終導(dǎo)致腎小球硬化和基質(zhì)積聚而引起DN[11]，Manabe等[12]通過降低PKC的活性可以明顯延緩DN的發(fā)生;本實驗亦顯示腹腔注射黃芪后腎組織PKC及TGF-β1表達下調(diào)，提示PKC同TGF-β1共同參與抗腎臟組織纖維化、保護腎臟的功能。

綜上可知，黃芪具有明顯改善糖尿病組大鼠腎功能，同時在腎組織抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用，具有明顯的劑量依賴關(guān)系。這在臨床上黃芪治療DN患者提供了重要的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2019-08-26） （本文編輯：郎序瑩）