奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型研究及其在中醫(yī)方面應(yīng)用進(jìn)展

李明珠，王文萍，金圣博

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng) 110042； 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032)

奧沙利鉑是用于消化道惡性腫瘤及婦科惡性腫瘤的常用化療藥物，大約90%的患者在使用此藥后會(huì)誘發(fā)特有的急性化療后誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)，臨床表現(xiàn)癥狀為疼痛、麻木，手部、足部和口腔周圍的感覺(jué)障礙，遇冷引發(fā)或加重，10% ～ 15%患者經(jīng)過(guò)多次化療后出現(xiàn)了累積和慢性CIPN，如感覺(jué)喪失和運(yùn)動(dòng)障礙,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-5]。而中醫(yī)藥憑借獨(dú)特的辨證論治理論體系，在防治此病有所建樹[6-7]，是目前研究的熱點(diǎn)，但因其治療機(jī)制的探討和研究，仍亟需加強(qiáng)。因此，在機(jī)理研究時(shí)選擇理想的大鼠CIPN動(dòng)物模型及檢測(cè)方法，已成為CIPN的中醫(yī)防治及病因病機(jī)等研究極為關(guān)鍵的步驟。目前機(jī)理研究中常選用大鼠CIPN模型，但因尚無(wú)明確的分類及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，使現(xiàn)有的動(dòng)物模型無(wú)法得到充分合理的運(yùn)用，對(duì)研究結(jié)果的可靠性產(chǎn)生影響。故此文介紹大鼠急性CIPN及慢性CIPN模型的建立方法、評(píng)價(jià)以及應(yīng)用，以期為實(shí)驗(yàn)中大鼠CIPN模型的選擇提供參考，從而構(gòu)建出更貼合臨床實(shí)際的動(dòng)物模型,為中西醫(yī)防治腫瘤并發(fā)癥研究創(chuàng)造理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

1 奧沙利鉑所致神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立的主要方法

大鼠CIPN模型，分為急性模型和慢性模型兩種，急性模型采用單次注射一定劑量奧沙利鉑所誘導(dǎo)，慢性模型采用多次注射一定總量的奧沙利鉑所誘導(dǎo)，常用注射方式為腹腔注射或者鼠尾靜脈注射，急性和慢性的造模方式與臨床上單次化療造成急性CIPN模型和多次化療所造成慢性CIPN模型相一致。注射藥物的方式有鼠尾靜脈注射和腹腔注射兩種方式，腹腔注射主要不良反應(yīng)為腹膜腫脹[8]，但兩者均有較好的安全性并簡(jiǎn)易的操作性。2002年，世衛(wèi)組織推薦奧沙利鉑大鼠使用劑量為每周兩次注射2 ～ 3 mg/kg奧沙利鉑，直至注射9次，在一些學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)，奧沙利總使用劑量8 ～ 16 mg/kg大鼠無(wú)明顯惡化，體重增長(zhǎng)速度和正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，臨床狀況良好[9]，當(dāng)單次劑量達(dá)到4 mg/kg，累積劑量達(dá)到32 mg/kg及以上劑量組，可能出現(xiàn)大鼠死亡[9-10]。即根據(jù)奧沙利鉑臨床成人常用劑量(130 mg/m2)，按照動(dòng)物種屬與用藥轉(zhuǎn)換公式， 換算出大鼠的用藥劑量為20 mg/kg，當(dāng)劑量達(dá)到32 mg/kg換算成人體為180 mg/kg[11]。大鼠接受奧沙利鉑注射后會(huì)出現(xiàn)一些行為學(xué)變化，如攝食減少、消瘦、體重增長(zhǎng)變緩等表現(xiàn)，與注射劑量增加和注射間隔時(shí)間長(zhǎng)短，呈正相關(guān)[9]，并可以出現(xiàn)四肢末端皮膚顏色略蒼白，肌肉萎縮，舔足、抬足活動(dòng)增加等行為表現(xiàn)，進(jìn)一步可能出現(xiàn)機(jī)械痛閾、冷熱痛閾的改變，研究中可以通過(guò)如上的表現(xiàn)來(lái)判斷是否造模成功。以下表格詳細(xì)敘述常用的急性和慢性造模方式、行為表現(xiàn)及安全性。大鼠均選取SD或Wistar大鼠，雄性或者雌性無(wú)明顯差別。見表1-3。

2 成模檢測(cè)方法

奧沙利鉑化療后誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺(jué)障礙等，在大鼠CIPN模型中也有所體現(xiàn)，一般通過(guò)機(jī)械痛閾，冷、熱痛閾的改變，來(lái)判斷造模是否成功及治療的有效性評(píng)價(jià)，下面介紹常用的成模的具體檢測(cè)方法：

表1 大鼠神經(jīng)病理性疼痛急性模型Table 1 CIPN acute model of rat

注：i.p： 腹腔注射； i.v： 靜脈注射； CA：冷痛覺(jué)； HH：熱痛覺(jué)過(guò)敏；HHO：熱痛覺(jué)； MA：機(jī)械痛閾；MH：機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。 (+)表示這種行為是經(jīng)過(guò)評(píng)估的，給藥奧沙利鉑后有類似疼痛的行為，(-)表示這種行為是經(jīng)過(guò)評(píng)估的，但在奧沙利給藥后不明顯。下表同。

Note. i.p,intraperitoneal. i.v, intravenous. CA, cold allodynia. HH, heat hyperalgesia. HHO, heat hypoalgesia. MA, mechanical allodynia. MH, mechanical hyperalgesia. Symbols: (+) indicates presence of pain-like behaviour following oxaliplatin n administration， (-) indicates this behaviour was assessed but not evident following oxaliplatin administration. The same in the following tables.

表2 大鼠神經(jīng)病理性疼痛慢性模型Table 2 CIPN chronic model of rat

表3 大鼠神經(jīng)病理性疼痛造模注射方式Table 3 CIPN model injection method of rat

2.1 機(jī)械痛閾檢測(cè)方法及測(cè)定

2.1.1 蘭德爾壓足試驗(yàn)疼痛閾值檢測(cè)(Randall-Selitto paw-withdrawal test)

在安靜、溫度(20 ～ 22℃)控制的房間內(nèi)，上午10：00～下午4：00 時(shí)間內(nèi)，使用Basile Algesy測(cè)量?jī)x(芝加哥，伊利諾伊州)檢測(cè)大鼠的壓爪閾值。使大鼠爬進(jìn)帶SLAN的Perspex圓柱形束縛器中，后腿一側(cè)的TED通風(fēng)孔可自由延伸，實(shí)驗(yàn)前使后腿自由伸展和適應(yīng)10 ～ 15 min，并暴露于試驗(yàn)刺激。采用Selitto壓足戒斷試驗(yàn)-行為實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，疼痛閾值定義為大鼠拔出爪子的克數(shù)。每只爪子作為一種獨(dú)立的測(cè)量手段，每個(gè)實(shí)驗(yàn)在單獨(dú)的一組大鼠身上進(jìn)行，給藥前后測(cè)定戒斷閾值(即痛閾值)，每間隔5 min進(jìn)行1次傷害感受閾值測(cè)量，共測(cè)量4次，最后3次的平均值記錄為疼痛閾值，戒斷壓力為200 g[12,22-24]。

2.1.2 馮·弗雷纖維絲疼痛閾值檢測(cè)(Von Frey hair)

因其簡(jiǎn)易操作，重復(fù)性高，此為最常用的檢測(cè)方式。在安靜、舒適房間內(nèi)，將大鼠放置于高架金屬篩網(wǎng)上，15 min適應(yīng)環(huán)境，從下面使用硬性Von Frey纖維絲(0.6、1、1.4、2、4、6、8、10、15和26 g)對(duì)每只后爪刺激最多4 s的時(shí)間，從塑料網(wǎng)下面插入，垂直地刺向其雙側(cè)后肢足底中部皮膚，緩慢增加刺激壓力，直到VFH纖維絲剛剛彎曲。治療前后對(duì)正常大鼠進(jìn)行測(cè)量，試驗(yàn)包括在每只后爪上進(jìn)行5次重復(fù)的VFH測(cè)試(頻率為每1 ～ 1.5/次)，刺激5次出現(xiàn)3次縮足，則此纖維絲的刺激強(qiáng)度即為有效強(qiáng)度；反之，則為無(wú)效強(qiáng)度。當(dāng)某一刺激強(qiáng)度的纖維對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為有效強(qiáng)度時(shí)，則選用低一級(jí)刺激強(qiáng)度的von Frey絲進(jìn)行刺激，直至出現(xiàn)無(wú)效強(qiáng)度，那么最小的有效強(qiáng)度則為該肢體的刺激反應(yīng)閾值(Mechanical withdrawal threshold，MWT)[10,12,14,18,20,22,25-27]。

2.2 機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定

2.2.1 蘭德爾足壓試驗(yàn)(Randall-Selitto)

使用Ugo Basile鎮(zhèn)痛儀對(duì)大鼠后足施加壓力壓力，用于量化傷害性閾值的參數(shù)是大鼠發(fā)出痛苦叫聲。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直到得到兩個(gè)相似的連續(xù)壓力值。切斷壓力為450 g[10,14]。

2.2.2 4 g和15 g Von Frey纖維絲

將大鼠被放置在金屬篩網(wǎng)上(20 cm × 17 cm × 13 cm)，使用4 g或15 g的Von Frey 纖維絲，垂直地刺向其雙側(cè)后肢足底中部皮膚，緩慢增加刺激壓力，(每只后爪5次，即每只大鼠10次)，(頻率為每次1 ～ 1.5 s)，每次試驗(yàn)3 min，間隔每只3～ 5 s，計(jì)算對(duì)刺激的戒斷反應(yīng)次數(shù)，后足底撤退頻率測(cè)定 [即(足底撤退次數(shù)/5)×100]。用4 g Von Frey纖維絲引起幾乎不痛的刺痛感覺(jué)，正常大鼠很少對(duì)刺激產(chǎn)生反應(yīng)，15 g Von Frey纖維絲刺激大約20%會(huì)引起戒斷反射，因此對(duì)4 g或15 g Von Frey 纖維絲刺激的反應(yīng)表現(xiàn)為機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏[18-19,29]。

2.3 冷痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定(冷痛閾測(cè)定)

2.3.1 冷水浴鼠尾撤尾法

將大鼠的鼠尾浸入法在(4℃ 或 10℃)溫度下的水浴中進(jìn)行，老鼠的尾巴浸泡水中，直到尾巴被取出來(lái)，記錄尾部浸泡時(shí)間，每隔5 min進(jìn)行3 ～ 5次測(cè)量，記錄平均值，切斷時(shí)間為15 s。治療前對(duì)正常大鼠進(jìn)行的測(cè)量作為正常參考值[10,12,14,16,24]。

2.3.2 冷板試驗(yàn)測(cè)定

每只大鼠被放置在一個(gè)透明的塑料盒子(20 cm× 17 cm × 13 cm)中，上面有一個(gè)鐵絲網(wǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境后，用保持在8℃的截形鋁錐的尖端與老鼠的后爪子接觸，直至大鼠拔出后足，觀察大鼠的后足撤退時(shí)間，10次試驗(yàn)(左右足各5次試驗(yàn))，每隔1 min進(jìn)行一次，切斷時(shí)間為15 s，以避免對(duì)爪子造成傷害[15]。

2.3.3 丙酮試驗(yàn)測(cè)定

(1)大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機(jī)玻璃罩(23 cm × 17 cm× 13 cm)，測(cè)試前先使大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，待梳理探究活動(dòng)消失后，將一滴(0.05 ml)丙酮放在足底后爪中央，根據(jù)反應(yīng)給予4分制評(píng)分：0分=無(wú)反應(yīng)；1分=快速拔出后足；2分=長(zhǎng)時(shí)間退縮；3分=反復(fù)拍打后組或天后足內(nèi)側(cè)。對(duì)每只大鼠兩足使用丙酮分別檢測(cè)3次，得到累積分?jǐn)?shù)，最低得分為0，最高得分為18分[18]。

(2)將50 μL丙酮用微噴霧器3次噴在每只后爪的足底皮膚上，以開始噴灑時(shí)為0時(shí)，計(jì)時(shí)40 s，統(tǒng)計(jì)大鼠40 s內(nèi)縮足次數(shù)。左右各3次， 共計(jì)6次[27][28]。

2.3.4 全自動(dòng)智能冷板儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技有限公司)

將冷板儀溫度設(shè)置在4℃，待溫度恒定后，將大鼠置于冷板儀上，蓋以有機(jī)玻璃罩。讓其先適應(yīng)1 min。計(jì)數(shù)60 s，觀察大鼠60 s內(nèi)反應(yīng)，其中出現(xiàn)輕微躲避反應(yīng)如抬足、添足、后退等計(jì)1分，強(qiáng)烈的躲避反應(yīng)如跳起來(lái)計(jì)2分，無(wú)任何反應(yīng)計(jì)0分。統(tǒng)計(jì)每只大鼠60 s內(nèi)總分?jǐn)?shù)[30]。

2.4 熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定(熱痛閾測(cè)定)

2.4.1 熱輻射鼠后足法

將大鼠置3 min厚的玻璃板上的有機(jī)玻璃箱內(nèi)， 適應(yīng)環(huán)境15 min，熱輻射儀照射大鼠后肢足底中部皮膚， 同時(shí)開始計(jì)時(shí)，當(dāng)出現(xiàn)抬足、舔足，逃避等反應(yīng)時(shí)讀輻射儀上的時(shí)間。調(diào)節(jié)照射光源強(qiáng)度，使正常大鼠潛伏期維持在10 ～ 20 s之間；設(shè)置自動(dòng)切斷時(shí)間為30 s，防止燒傷大鼠皮膚。大鼠雙足分別連續(xù)測(cè)量5次，每次間隔5 s，去除最大和最小值后計(jì)算平均值，即為大鼠的熱痛閾值。正常大鼠在任何治療前的測(cè)量作為對(duì)照[12]。

2.4.2 熱輻射鼠尾法

使用輻射熱測(cè)痛儀UgoBasil (意大利米蘭)的甩尾試驗(yàn)和設(shè)備測(cè)量大鼠的熱傷害性閾值。測(cè)痛儀由24 V，25 W 聚光燈泡制成，光線經(jīng)外罩上的聚光漏斗集中照射于鼠尾，漏斗外口直徑為3 mm，測(cè)痛時(shí)外口緊貼鼠尾，當(dāng)鼠尾產(chǎn)生突然抽搐時(shí)，即為甩尾反應(yīng)陽(yáng)性，傳感器會(huì)檢測(cè)到它，借助秒表記錄甩尾反應(yīng)潛伏時(shí)間(以下簡(jiǎn)稱痛閾)，秒表記錄最低限度為0.1 s。取尾尖部起始的2 cm處測(cè)痛，反復(fù)測(cè)痛3次，記錄平均值[25,31]。

2.4.3 熱水浴鼠尾浸泡試驗(yàn)

大鼠的鼠尾浸入法在較高(42℃或46℃)溫度下的水浴中進(jìn)行，大鼠的尾巴被浸泡在水中，直到尾巴被取出來(lái)，記錄尾部浸泡時(shí)間，每隔5 min進(jìn)行3 ～ 5次測(cè)量，記錄平均值，切斷時(shí)間為15 s。治療前對(duì)正常大鼠進(jìn)行的測(cè)量作為正常參考值[10,14,24]。

2.5 運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的測(cè)試

使大鼠在加速Rta-Rod跑步機(jī)(UgoBasile，Stoelting)上進(jìn)行試驗(yàn)。恒定速度(3.75 r/min)，將大鼠單獨(dú)放置在該裝置上，然后棒加速至37.5 r/min，記錄大鼠在旋轉(zhuǎn)桿上掉下來(lái)的時(shí)間，截?cái)鄷r(shí)間定為5 min[12]。

3 大鼠CIPN模型在中醫(yī)科研中的應(yīng)用

大鼠CIPN模型用于中醫(yī)治療奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，其機(jī)制的研究也具有重要意義。如蔡青等[32]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可拮抗奧沙利鉑化療大鼠引起的熱痛閾值和體重減輕。天佛參能抑制奧沙利鉑神經(jīng)毒性模型大鼠的體重減輕，有效地抑制奧沙利鉑誘發(fā)的末梢疼痛覺(jué)過(guò)敏癥狀，提高M(jìn)WT值，誘導(dǎo)μ、κ阿片受體表達(dá)升高[33]。雙筋龍湯可減輕化療致大鼠周圍神經(jīng)毒性,其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)大鼠L4-L5后根神經(jīng)節(jié)中NGF的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的[34]。

多個(gè)學(xué)者研究表現(xiàn)黃芪桂枝五物湯對(duì)奧沙利鉑化療后誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠有明確防治的療效，其治療機(jī)理可能與奧沙利鉑導(dǎo)致的背根神經(jīng)節(jié)核仁變化的改善、通過(guò)下調(diào)鈉離子通道亞型Nav1.7蛋白及基因表達(dá)量的增加相關(guān)[35]，還可能與降低血清、脊髓中丙二醛的含量來(lái)起到抗氧化作用從而保護(hù)周圍神經(jīng)元細(xì)胞，來(lái)達(dá)到減輕疼痛過(guò)敏及背根神經(jīng)節(jié)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[36]。在神經(jīng)保護(hù)方面，黃芪桂枝五物湯還被證實(shí)可以改善大鼠病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的病變[37]，并對(duì)髓鞘變性有確實(shí)的保護(hù)作用，提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，縮短病變持續(xù)時(shí)間[38]，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)大鼠L4-L5脊髓中NR2B的表達(dá)以及上調(diào)DRG中pNF-H蛋白水平來(lái)介導(dǎo)[39]。

一些中藥成分的提取物也證實(shí)對(duì)此病的防治的療效及探討相關(guān)機(jī)理。成薇婷等[40]研究表明在奧沙利鉑圍化療期大鼠注射丹參酮ⅡA 能提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，縮短病變持續(xù)時(shí)間，發(fā)揮保護(hù)外周神經(jīng)的作用。黃芩苷能顯著提高熱刺激縮足閾值，對(duì)于奧沙利鉑導(dǎo)致的熱痛覺(jué)過(guò)敏具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制脊髓部位的nNOS 合成有關(guān)[41]。絞股藍(lán)皂苷可改善奧沙利鉑所致大鼠周圍神經(jīng)毒性溫度和機(jī)械刺激下的行為學(xué)改變，其機(jī)制與上調(diào)NGF水平以及Nrf2信號(hào)通路有關(guān)[42]。人參皂苷Rg3對(duì)大鼠奧沙利鉑神經(jīng)毒性具有一定的保護(hù)作用，可增加NGF的表達(dá)，減少DRG神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[43]。

溫經(jīng)通絡(luò)散外用治療能夠明顯緩解周圍神經(jīng)毒疼痛，加快坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，能有效降低奧沙利鉑對(duì)坐骨神經(jīng)的損傷，其治療作用可能是通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，緩解坐骨神經(jīng)損傷，增加血清神經(jīng)因子表達(dá)，減少足底皮膚P物質(zhì)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[44]，也可能與抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)而介導(dǎo)的傷害性信號(hào)傳遞有關(guān)[45]加快坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低對(duì)坐骨神經(jīng)的損傷[46]及提高尾神經(jīng)SNCV以及NGF水平[47]，維持背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)興奮性氛基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體水平進(jìn)而抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的調(diào)亡、抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、及機(jī)械性痛覺(jué)及冷溫度刺激過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)[48]。見表4。

4 討論

大鼠CIPN模型造模和檢測(cè)簡(jiǎn)單方便，可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)成為了國(guó)內(nèi)外研究者常用的模型，具有十分廣闊的發(fā)展前景，是腫瘤疼痛研究的重要手段和平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)研究中可以根據(jù)模型的特點(diǎn)以及本身治療手段特點(diǎn)和實(shí)際需要選擇適當(dāng)動(dòng)物模型，對(duì)于研究結(jié)果的可靠性具有重要意義。

表4 大鼠CIPN模型在中醫(yī)中應(yīng)用Table 4 Rat CIPN model applied in Chinese medicine

西藥對(duì)于奧沙利鉑誘導(dǎo)的CIPN沒(méi)有明確的預(yù)防藥物，治療藥物為抗抑郁藥如度洛西汀及止疼類藥物[48]，療效不佳及副反應(yīng)較大，中醫(yī)憑借獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)辨證論治理論體系，在奧沙利鉑化療后誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛(CIPN)的治療方面取得了顯著療效，為此需要更精準(zhǔn)的動(dòng)物模型和更為有效的檢測(cè)方法來(lái)深入研究和探索具體作用機(jī)制及治療機(jī)理。但目前沒(méi)有中醫(yī)相關(guān)大鼠CIPN模型的造模體系，如何將大鼠模型和奧沙所致CIPN中醫(yī)辨證相關(guān)的“虛”“寒”“淤”分型相結(jié)合，建立中醫(yī)的相關(guān)動(dòng)物模型，與中醫(yī)理論相結(jié)合，對(duì)于中醫(yī)科研探索此病的治療機(jī)制更有指導(dǎo)意義，進(jìn)一步完善和建立中醫(yī)大鼠CIPN模型標(biāo)準(zhǔn)是日待解決問(wèn)題。發(fā)揮中醫(yī)治療此病有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，才能在國(guó)際發(fā)病更有影響力的文章。