結(jié)直腸癌小鼠模型研究進(jìn)展

苗晉鑫，宋韶鶴，李秀敏

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥科學(xué)院，鄭州 450000； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，藥學(xué)部，鄭州 450000； 3. 紐約醫(yī)學(xué)院，微生物與免疫學(xué)系，耳鼻喉系，紐約 10595)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大常見惡性腫瘤。在中國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率占惡性腫瘤排名第3名和第5名[1]。研究CRC發(fā)病機制、浸潤轉(zhuǎn)移及治療藥物的反應(yīng)對改善CRC患者預(yù)后至關(guān)重要。CRC小鼠模型為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤治療的基本工具。將CRC小鼠模型分為自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型、移植性模型、轉(zhuǎn)基因模型。但是沒有一個模型概括出整個結(jié)直腸癌發(fā)展的過程，根據(jù)特定的研究目的選擇合適的CRC小鼠模型至關(guān)重要。本綜述旨在介紹常用CRC小鼠模型方法，比較其優(yōu)缺點，為CRC的研究提供參考。

1 自發(fā)性模型

自發(fā)性胃腸道腫瘤在小鼠中很少見。研究發(fā)現(xiàn)，9.5%的C57BL/6老年小鼠在胃腸道中具有腫瘤或增生性病變，小腸多是上皮腺腺瘤或腺癌，結(jié)腸中僅有兩個上皮腺腺瘤[2]。自發(fā)性CRC小鼠代表了人類自然狀態(tài)下發(fā)生CRC，但是發(fā)生時間極長且癌變率極低。

2 誘發(fā)性模型

2.1 飲食誘發(fā)性模型

流行病學(xué)表明富含脂肪食物和纖維含量低的食物可增加人類結(jié)直腸癌的風(fēng)險[3]。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)西式飲食(高脂肪、低鈣和低維生素D3)喂食1.5年小鼠可誘導(dǎo)CRC的發(fā)生，且小鼠顯示75%的APC+/-和57%的Muc2-/-突變。飲食誘發(fā)性小鼠模型代表了人類食物引起的CRC發(fā)生的基本復(fù)雜性，但不能評估哪些突變導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。

2.2 化學(xué)物誘導(dǎo)模型

2.2.1 DMH和AOM

化合物1,2-二甲基肼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)是兩個最常用誘導(dǎo)散發(fā)性CRC小鼠模型的腫瘤誘導(dǎo)物。Marion等[5]用DMH連續(xù)給藥10周，在20 ～ 24周發(fā)現(xiàn)60%的小鼠出現(xiàn)結(jié)直腸癌。在給藥期間AOM比DMH具有更強的效力和更高的穩(wěn)定性。Necfert等[6]用AOM重復(fù)腹腔注射小鼠30周，可誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌。DMH和AOM化學(xué)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)病機制及腫瘤生長環(huán)境與人相似，方法相對簡單，是研究中非常有用的模型。但是誘導(dǎo)周期較長，腫瘤轉(zhuǎn)移率過低，不能用于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移模型的研究。

2.2.2 PhIP

2-氨基-1-甲基-6-苯基亞氨基[4,5-b]吡啶(PhIP)是烤魚和烤肉時產(chǎn)生的雜環(huán)胺，是小鼠中引起結(jié)腸癌的誘變劑。Andreassen等[7]將3 ～ 4 d大的APCmin小鼠皮下注射50 mg/kg PhIP，11周后發(fā)現(xiàn)大腸內(nèi)腫瘤和囊性隱窩的數(shù)量增加。Tanaka等[8]將CD-1小鼠單次給予200 mg/kg PhIP聯(lián)合DSS喂水1周，16周后小鼠出現(xiàn)結(jié)腸腫瘤。PhIP常用于不同遺傳背景的大鼠腸癌模型的研究。

3 移植性模型

3.1 皮下移植瘤模型

皮下移植瘤是指將人的結(jié)直腸癌細(xì)胞或患者結(jié)直腸腫瘤組織接種在免疫缺陷小鼠的皮下，使免疫缺陷小鼠皮下形成腫瘤組織。李井泉等[9]通過在裸鼠皮下注射LoVo細(xì)胞懸液，成功建立CRC皮下移植瘤模型，用于評價PLGA-5-氟尿嘧啶緩釋微球的治療效果。李小穎等[10]利用紅色和綠色熒光蛋白標(biāo)記HCT-116細(xì)胞建立光學(xué)CRC腫瘤模型，動態(tài)觀察HCT-116腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下生長過程。Burgenske等[11]利用來自CRC患者手術(shù)切除的腫瘤組織皮下植入裸鼠，成功建立了CRC患者來源的異種移植(patient-derived tumor xenograft, PDX)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC PDX模型在細(xì)胞和遺傳水平上都表現(xiàn)出異質(zhì)性，并且組織學(xué)顯示腺體形成的柱狀上皮樣結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生粘蛋白的細(xì)胞的存在的特性。皮下移植瘤模型操作簡單和成瘤率高，方便實時監(jiān)測腫瘤的生長情況和評估藥物治療效果，但是皮下移植瘤模型不是自然形成腫瘤，難以模擬人結(jié)直腸腫瘤原位生長的情況和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的特性。

3.2 原位移植瘤模型

原位移植模型彌補了皮下移植瘤模型難模擬結(jié)直腸腫瘤原位生長情況和侵襲轉(zhuǎn)移特性。Hite等[12]利用熒光素酶標(biāo)記的HT-29腫瘤細(xì)胞注射NOD/SCID小鼠直腸，建立了模擬CRC患者原發(fā)腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移模型。小鼠CRC肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移模型的方法有很多[13-14]，本文不作過多描述。原位移植可模擬人結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的過程，可獲得CRC腫瘤組織細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞間協(xié)同性，原位移植的成瘤率高。但是手術(shù)操作復(fù)雜，小鼠易死亡，不易觀察腫瘤生長情況。

4 轉(zhuǎn)基因模型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因?qū)胨拗骰蚪M，在染色體中穩(wěn)定整合并遺傳給下一代。轉(zhuǎn)基因技術(shù)類型多樣，但是應(yīng)用較多和較穩(wěn)定的是顯微注射技術(shù)，該技術(shù)利用顯微注射儀將外源基因通過顯微注射入受精卵雄核獲得轉(zhuǎn)基因動物[15]?；蚯贸Y(jié)直腸癌模型就是將相關(guān)的抑癌基因等人為缺失掉，包括新型基因組修飾技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)和Cre/loxp誘導(dǎo)的條件敲除體系法[16]。

4.1 結(jié)腸癌腺瘤性息肉模型

結(jié)腸癌腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli, APC)基因作為抑癌基因直接參與Wnt信號通路，影響細(xì)胞周期G1向S轉(zhuǎn)變，APC突變導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞生長失調(diào)，導(dǎo)致腸道形成CRC[17]。80%散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生第一步可能是APC突變引起。APCMin/+轉(zhuǎn)基因小鼠是研究腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的經(jīng)典模型。隨后多種類型APC轉(zhuǎn)基因小鼠模型被開發(fā)用于 CRC的研究[18]。條件性APC小鼠模型構(gòu)建用于研究不同發(fā)育階段腸道以外器官中的功能。Robanus等[19]構(gòu)建一個條件缺失外顯子15的APC15lox/+轉(zhuǎn)基因小鼠模型，小鼠表現(xiàn)更長的生存期并導(dǎo)致結(jié)直腸發(fā)生和發(fā)展腫瘤，與人類家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)的散發(fā)性結(jié)直腸癌相似。Takaku等[20]將Smad4突變引入APCΔ716小鼠導(dǎo)致局部侵襲性惡性腺癌而無轉(zhuǎn)移。與APCMin小鼠相比，BubR1+/-和APCMin小鼠導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤數(shù)量增加10倍[21]。

4.2 遺傳性非息肉模型

遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)患者在結(jié)腸和直腸中發(fā)生較早，一般多由MMR基因突變，如Mlh1、Msh2和Msh6。純合Mlh1、Msh2和Msh6敲除小鼠表現(xiàn)包括胃腸道在內(nèi)的多個器官中發(fā)生腫瘤，但是小鼠過早死于侵襲性淋巴瘤，這與具有雙等位基因錯配修復(fù)突變的患者非常相似[22-23]。與HNPCC患者的腫瘤相似，Msh2-/-小鼠的腫瘤具有較高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite in stability, MSI)[22]。

4.3 其他模型

KrasV12G/APC+/1638 N轉(zhuǎn)基因小鼠模型的腸道腫瘤增殖更快，并且凋亡水平降低[24]。Pten和Pik3ca基因突變小鼠與Apc基因突變小鼠雜交，加速小鼠形成腸腺癌[25]。當(dāng)Pik3ca在腸內(nèi)單獨表達(dá)時，小鼠會發(fā)展為浸潤性粘液腸道腺癌[26]。APCMin/+Tp53-/-雙基因突變或刪除的C57BL6/J背景的小鼠表現(xiàn)更高腫瘤負(fù)荷和侵襲性腫瘤發(fā)展[27]。Paul等[28]開發(fā)了由Car1基因驅(qū)動的可誘導(dǎo)盲腸和近端結(jié)腸特異性Car1CreER敲入小鼠模型，從而可對Cre活動進(jìn)行時時控制。

5 結(jié)論與展望

結(jié)直腸癌小鼠模型在結(jié)直腸癌發(fā)病原因、機制和治療研究中起著關(guān)鍵作用。目前四種不同的CRC小鼠模型，每種模型只能部分地模擬人結(jié)直腸癌特征，這些模型可能預(yù)測治療臨床療效的能力有限。因此，要根據(jù)特定的實驗?zāi)康?，選擇相對較優(yōu)的模型(表1)。自發(fā)和食物誘導(dǎo)的模型常用于研究對CRC形成的治療或預(yù)防作用?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的小鼠模型模擬人類散發(fā)性結(jié)直腸癌，并且常用于研究飲食對癌變的影響。原位接種的CRC小鼠模型概括了CRC原位發(fā)生及轉(zhuǎn)移的一些特征，多用于抗腫瘤及轉(zhuǎn)移藥物評估?；蚬こ绦∈竽Ｐ涂捎糜谘芯刻囟ɑ蚪M改變在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展的重要性及其對各種治療的敏感性。常用的化學(xué)誘導(dǎo)和遺傳小鼠模型無法再現(xiàn)人類疾病的復(fù)雜性，移植性人結(jié)腸癌細(xì)胞于小鼠可能受到長期培養(yǎng)的細(xì)胞系，不再反映新鮮分離的腫瘤的特征細(xì)胞。根據(jù)各種模型的優(yōu)缺點，結(jié)合實驗?zāi)康倪x擇合適小鼠模型。期待通過發(fā)展新技術(shù)和方法建立更好的CRC小鼠模型，以更好地指導(dǎo)CRC分子機制和藥物治療研究。

表1 結(jié)直腸癌小鼠模型概況Table 1 The summary of mouse models of colorectal cancer