不同年齡段小鼠抑郁及焦慮樣行為的比較

楊穎雯，周瑾，黃菲

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所, 上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203)

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神疾病，可以影響思維、情緒和身體健康。它的特點(diǎn)是情緒低落、缺乏活力、悲傷、失眠和無(wú)法享受生活等[1]。焦慮是當(dāng)面對(duì)威脅或壓力時(shí)產(chǎn)生的恐懼感，當(dāng)面對(duì)危險(xiǎn)時(shí)，這是一種正常的反應(yīng)，但是，如果它是壓倒性的或者這種感覺(jué)持續(xù)存在，它可以被視為焦慮癥[2]。同時(shí)出現(xiàn)焦慮和抑郁癥狀比單獨(dú)出現(xiàn)的各種癥狀更為常見(jiàn)，超過(guò)三分之二的重度抑郁癥患者也報(bào)告有焦慮癥[3]。研究表明，抑郁與人的年齡差異呈倒“U”型關(guān)系[4]，抑郁動(dòng)物模型是研究抑郁癥的重要工具，考察不同年齡的小鼠抑郁焦慮樣行為有助于小鼠抑郁模型造模年齡的正確選擇，故本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究抑郁焦慮樣行為與小鼠年齡之間的關(guān)系。

5-羥色胺(5- hydroxytryptamine 5-HT)是一種多功能生物胺，在一系列生理途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。我們體內(nèi)的大部分5-HT都是在胃腸道粘膜內(nèi)被稱為腸嗜鉻細(xì)胞的特殊的腸內(nèi)分泌細(xì)胞中合成的，它們提供了我們所有的循環(huán)5-HT[5]。5-HT主要分布在外圍系統(tǒng)中，只有少量的5-HT位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，中樞系統(tǒng)中的5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)情緒、睡眠、學(xué)習(xí)記憶等生理活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)和5-HT多層面驗(yàn)證不同年齡小鼠的抑郁焦慮樣行為的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

根據(jù)文獻(xiàn)[6]選擇不同年齡的清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠27只，9只1月齡，體重(20 ± 2)g；9只8月齡，體重(32 ± 4)g；9只16月齡，體重(37 ± 4)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2017-0005】，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境【SYXK(滬)2014-0008】，適應(yīng)性飼養(yǎng)2月后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中符合上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求(倫理審批號(hào)：SZY201707016)。

1.1.2 試劑及儀器

5-HT(Sigma，H9523)，乙腈(Fisher Chemical，173534)，甲醇(Fisher Chemical，138507)，甲酸(Fisher Chemical，172433)。

低溫冷凍離心機(jī)(5424R，德國(guó)Eppendorf公司)，高通量組織研磨機(jī)(TL-48E，上海凈信科技公司)，渦旋振蕩儀(MX-S，Dragonlab)，液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(DEBAF01206，安捷倫)，色譜柱(C18-BEH，美國(guó)Waters公司)，全自動(dòng)氮吹濃縮儀(5T250，美國(guó)Biotage公司)，懸尾、強(qiáng)迫游泳、開(kāi)放曠場(chǎng)及高架十字迷宮測(cè)試儀(上海移數(shù)信息科技有限公司)，行為學(xué)分析軟件(EthoVision XT，荷蘭Noldus公司)。

1.2 方法

1.2.1 懸尾測(cè)試(tail suspension test，TST)

將小鼠倒掛并用膠帶將尾部黏在在水平桿上，小鼠頭部與地面保持7 ～ 8 cm的距離，記錄每只小鼠在6 min中的后4 min里的累積不動(dòng)時(shí)間。

1.2.2 強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swimming test，F(xiàn)ST)

將小鼠置于裝有18 cm深清水的透明柱型容器內(nèi)(高30 cm，直徑20 cm)，并將水溫保持在(25 ± 1)℃，記錄每只小鼠在6 min中的后4 min里的累積不動(dòng)時(shí)間。

1.2.3 高架十字迷宮測(cè)試(elevated plus maze test，EPMT)

將小鼠放在十字迷宮的中間，頭面向開(kāi)臂開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間，另記錄小鼠的探頭次數(shù)。每只小鼠測(cè)試之后用75%的酒精清潔儀器，并保持實(shí)驗(yàn)過(guò)程安靜且光線均勻。

1.2.4 曠場(chǎng)測(cè)試(open field test，OFT)

將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱(長(zhǎng)60 cm，寬60 cm，高60 cm)中行為學(xué)分析軟件記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)總路程。每只小鼠測(cè)試之后用75%的酒精清潔儀器，并保持實(shí)驗(yàn)過(guò)程安靜且光線均勻。

1.2.5 糖水偏好測(cè)試(sugar preference test，SPT)

測(cè)試之前，給每籠小鼠糖水和純水各一瓶適應(yīng)1 d，糖水適應(yīng)結(jié)束后，同時(shí)給每籠小鼠糖水和純水各一瓶，測(cè)試60 h，測(cè)試過(guò)程中每12 h交換1次水瓶位置，記錄糖水和純水消耗量，計(jì)算糖水偏好率。糖水偏好率等于糖水的消耗量除以糖水和純水的總消耗量。

1.2.6 LC-MS/MS法檢測(cè)C57小鼠血清5-羥色胺的含量

血清從-80℃的冰箱取出后放于冰上解凍，完全解凍后吸取100 μL轉(zhuǎn)移至新EP管中，每份樣品各加入400 μL的含0.1%甲酸的冰甲醇，渦旋1 min，4℃ 15 000 r/min離心15 min；取上清液，用氮?dú)鈸]干，每份樣品再加100 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混勻，再次4℃15000 rpm離心15 min，取80 μL上清液至液相小瓶中待分析。液相條件：用0.1%甲酸-水、乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：0 ～ 4 min 2%乙腈；6 min 80%乙腈；8 ～ 10 min 90%乙腈；柱溫：30℃；流速0.1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃。LC-MS/MS色譜條件參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抑郁樣行為

2.1.1 懸尾測(cè)試

中年組小鼠的不動(dòng)時(shí)間比老年組小鼠的不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，差異具有顯著性(P< 0.05)。青年組小鼠的不動(dòng)時(shí)間略短于中年組小鼠的不動(dòng)時(shí)間，但長(zhǎng)于老年組小鼠的不動(dòng)時(shí)間，見(jiàn)圖1(F(2,24)=4.897)。

2.1.2 強(qiáng)迫游泳測(cè)試

青年組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著長(zhǎng)于中年組(P< 0.001)和老年組小鼠(P< 0.001)；中年組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間亦顯著長(zhǎng)于老年組小鼠(P< 0.01)，見(jiàn)圖2(F(2,24)=38.950)。

2.1.3 糖水偏好測(cè)試

老年組小鼠12 h糖水偏好率顯著低于青年組(P< 0.05)和中年組小鼠(P< 0.05)，見(jiàn)圖3A(F(2,23)=4.909)；青年組小鼠36 h糖水偏好率顯著高于老年組小鼠(P< 0.05)，見(jiàn)圖3B(F(2,23)=4.703)；青年組小鼠48 h糖水偏好率亦顯著高于老年組小鼠(P< 0.05)，見(jiàn)圖3C(F(2,23)=5.017)；青年組小鼠60 h糖水偏好率仍顯著高于老年組小鼠(P< 0.05)，見(jiàn)圖3D(F(2,23)=4.450)。

2.2 焦慮樣行為

2.2.1 高架迷宮測(cè)試

老年組小鼠開(kāi)臂時(shí)間顯著長(zhǎng)于青年組(P<0.05)，見(jiàn)圖4A(F (2,22)=3.738)；青年組小鼠探頭次數(shù)顯著多于中年組小鼠(P=0.01)，見(jiàn)圖4B(F (2,24)=7.460)。

2.3 自主活動(dòng)(開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試)

青年組小鼠在曠場(chǎng)中的移動(dòng)總距離顯著大于老年組小鼠(P< 0.05)，見(jiàn)圖5(F(2,24)=3.628)。

注：青年組與老年組相比，*P< 0.05。青年組與中年組相比，**P < 0.01。圖4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)Note. Young group compared with old group,*P< 0.05. Young group compared with middle-aged group,**P < 0.01.Figure 4 Elevated plus maze test

2.4 LC-MS/MS法檢測(cè)C57BL/6小鼠血清5-羥色胺含量

如圖6(F(2,24)=6.730)所示，青年組、中年組和老年組小鼠血清5-羥色胺含量依次呈遞增趨勢(shì)，青年組小鼠血清5-羥色胺含量顯著低于中年組小鼠(P< 0.05)和老年組小鼠(P< 0.01)。

注：青年組與老年組相比，*P< 0.05。圖5 曠場(chǎng)總距離Note. Young group compared with old group,*P < 0.05.Figure 5 Total distance travelled in open field

注：青年組與中年組相比，*P < 0.05。青年組與老年組相比，**P < 0.01。圖6 小鼠血清中5-羥色胺含量Note. Young group compared with middle-aged group,*P < 0.05. Young group compared with old group,**P < 0.01.Figure 6 Concentration of 5-HT in mice serum

3 討論

抑郁癥和焦慮癥是常見(jiàn)的精神疾病，抑郁癥更是預(yù)計(jì)在未來(lái)將會(huì)發(fā)展為繼冠心病后的第二大疾病[8]。多種行為學(xué)方法被用來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的抑郁及焦慮樣行為，本研究選用了常見(jiàn)的懸尾、強(qiáng)迫游泳、糖水偏好、高架十字迷宮和開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)不同年齡小鼠的抑郁及焦慮樣行為。

懸尾測(cè)試是用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠抑郁行為的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)小鼠被掛在水平桿上，一開(kāi)始會(huì)處于本能激烈地掙扎試圖逃離困境，但若不能脫困，會(huì)陷入絕望狀態(tài)靜止不動(dòng)，表現(xiàn)出抑郁樣行為[9]。本研究中，中年組小鼠不動(dòng)時(shí)間與青年組小鼠接近，明顯高于老年組小鼠故提示，青年組小鼠與中年組小鼠比老年組小鼠在懸尾的同一刺激下更易表現(xiàn)出抑郁樣行為。強(qiáng)迫游泳測(cè)試亦廣泛用于評(píng)價(jià)小鼠抑郁樣行為，與懸尾類(lèi)似的，以不動(dòng)時(shí)間評(píng)價(jià)抑郁行為狀態(tài)。本結(jié)果提示，在強(qiáng)迫游泳的刺激下，年齡越小越容易表現(xiàn)出抑郁樣的行為。糖水偏好測(cè)試亦用來(lái)測(cè)試小鼠抑郁行為，小鼠越不嗜糖，越易出現(xiàn)快感缺失的抑郁狀態(tài)[10]。在本研究中，各年齡小鼠12、26、48、60 h糖水偏好率整體差距不大，青年組略高于中年組，中年組略高于老年組。高架迷宮測(cè)試可以用來(lái)評(píng)價(jià)焦慮樣行為，基于動(dòng)物既想探索新環(huán)境又恐懼開(kāi)放臂的矛盾狀態(tài)[11]，小鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間越短越焦慮[12]。本研究中，老年組、中年組、青年組小鼠的焦慮程度呈遞增趨勢(shì)，結(jié)果提示，在高架迷宮中，年齡越小越容易表現(xiàn)出焦慮樣的行為。開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試也是用來(lái)評(píng)價(jià)焦慮樣行為的，用來(lái)考察小鼠自主活動(dòng)和探究行為[13]，測(cè)試過(guò)程中小鼠在曠場(chǎng)中活動(dòng)的總距離越長(zhǎng)，則小鼠自主活動(dòng)越多[14]。本研究結(jié)果顯示，青年組的自主活動(dòng)最多，這與青年組小鼠在高架十字迷宮中探頭次數(shù)增多一致，同時(shí)也排除了因自主活動(dòng)的不同所造成的抑郁或焦慮樣行為測(cè)試結(jié)果的偏差。

5-羥色胺是一種單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明，抑郁癥患者大多會(huì)出現(xiàn)5-HT含量下降的情況[15]，李玉波等[16]研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥肝郁脾虛證大鼠模型的海馬內(nèi)5-HT含量降低，李培育等[17]研究發(fā)現(xiàn)血清5-HT濃度的增加可治療焦慮性失眠，緩解焦慮情緒。在本實(shí)驗(yàn)中，青年組、中年組、老年組血清5-HT濃度依次增加，故在同樣的刺激下，出現(xiàn)抑郁焦慮樣行為也依次減少，與行為學(xué)結(jié)果一致。

本研究通過(guò)對(duì)不同年齡段小鼠抑郁焦慮樣行為的比較發(fā)現(xiàn)，整體而言，同一刺激下，小鼠的年齡越小，越易表現(xiàn)出抑郁及焦慮樣行為，并且還比較了三組小鼠血清中5-HT的含量，發(fā)現(xiàn)青年組小鼠較中年組小鼠以及老年組小鼠血清5-HT水平更低，其中的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。該結(jié)果將有助于選擇合適年齡的實(shí)驗(yàn)小鼠用于抗抑郁及抗焦慮藥物的藥效學(xué)評(píng)價(jià)。