多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)*

徐 益，王 佳，高 輝，朱雯梅，姚 瑤，方 塵

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院/云南心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650051)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類條件致病的革蘭陰性球桿菌，是導(dǎo)致醫(yī)院感染的重要致病菌。近些年來(lái)隨著廣譜抗菌藥物的大量使用及醫(yī)療侵入性操作的增加，鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥及泛耐藥菌株的檢出率逐年升高，其感染率及臨床致死率日趨嚴(yán)重[1]。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌最重要的耐藥機(jī)制[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及耐藥基因分布進(jìn)行了大量研究發(fā)現(xiàn)，由于地區(qū)差異性、醫(yī)院治療手段不同、從而使細(xì)菌面臨的選擇性壓力不同，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的異質(zhì)性。

本研究主要針對(duì)本院臨床各科室分離的94株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行耐藥性分析及研究耐藥基因中具有代表性的D 類絲氨酸苯唑西林酶中的OXA-23型和A 類超廣譜內(nèi)酰胺酶中的TEM型，檢測(cè)其陽(yáng)性率，分析耐藥表型與耐藥基因的關(guān)系，以便更好地了解多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況及耐藥基因在當(dāng)?shù)胤植嫉牧餍星闆r，及時(shí)合理的指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院2017年7月至 2018年12月各臨床科室分離標(biāo)本，篩選出其中的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共94株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)及其配套試劑、抗菌藥物紙片，Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細(xì)菌DNA提取試劑盒、Oligo公司的引物、MASTERMIX、瓊脂糖、DNA 標(biāo)志物，水浴箱、離心機(jī)、電泳儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn) 采用全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)，適當(dāng)補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)(K-B法和E-test)，藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果解釋參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，并用標(biāo)準(zhǔn)菌株做藥敏質(zhì)量控制。

1.4 耐藥基因檢測(cè)

1.4.1 DNA模板制備 用Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細(xì)菌DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取鮑曼不動(dòng)桿菌DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系：1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，25 μL MASTERMIX，2 μL的模板，21 μL蒸餾水，反應(yīng)體系總體積50 μL。引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。引物序列:OXA-23上游5′-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3′，下游 5′-ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度501 bp；TEM上游 5′-ATC AGC AAT AAA CCA GC-3′，下游 5′-CCC CGA AGA ACG TTT TC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度516 bp。反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃ 預(yù)變性 5 min，然后 94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 5 min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物分析 擴(kuò)增完產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠，110 V×35 min電泳，放入凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。電泳出現(xiàn)明亮的條帶并且該條帶與預(yù)期產(chǎn)物大小相同者送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI網(wǎng)站Blast比對(duì)分析，從而證實(shí)耐藥基因。

2 結(jié) 果

2.1 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類、頭孢類和青霉素類的耐藥率高達(dá)100.0%；對(duì)氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為100.0%，對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率分別高達(dá)為97.6%、92.6%，92.7%和91.5%，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米諾環(huán)素的耐藥率分別為88.3%、87.2%和60.7%。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性說(shuō)明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常規(guī)的抗菌藥物普遍耐藥，只對(duì)替加環(huán)素保持高度敏感，未檢測(cè)出耐藥菌株。見(jiàn)表1。

表1 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率分布(%)

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠成像上的陽(yáng)性目的條帶，計(jì)算得出攜帶OXA-23基因的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為86株，其陽(yáng)性率高達(dá)91.5%；攜帶TEM基因的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為81株，陽(yáng)性率為86.2%。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序產(chǎn)物序列使用BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示PCR引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物序列與Genebank 發(fā)布的OXA-23、TEM基因序列相符。說(shuō)明本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌多數(shù)攜帶OXA-23、TEM型耐藥基因。見(jiàn)圖1、2。

圖1 OXA-23 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖像

圖2 TEM 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖像

2.3 耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性 94株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌全部對(duì)碳青霉烯類、頭孢類抗菌藥物耐藥，檢測(cè)耐藥基因OXA-23型為86株，未攜帶OXA-23基因的為8株，其陽(yáng)性率高達(dá)91.5%；攜帶TEM基因?yàn)?1株，未攜帶TEM基因的為13株，陽(yáng)性率為86.2%。耐藥表型和耐藥基因檢出情況基本一致。見(jiàn)表2。

表2 耐藥菌株耐藥基因分布情況

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，在醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚黏膜表面或與外界相通的腔道中廣泛分布，因其具有極強(qiáng)的生存力和黏附力，常定植于醫(yī)院的床旁儀器、被褥等非生物表面，可通過(guò)醫(yī)務(wù)人員及器械傳播，成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌[3]。

鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，特別是隨著多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)，更是增加了臨床選擇抗菌藥物方面的困難。中國(guó)2018年CHINET數(shù)據(jù)顯示:不動(dòng)桿菌屬(鮑曼不動(dòng)桿菌占92.9%) 對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別是73.7% 和 75.6%，而細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥即意味著對(duì)其他抗菌藥物基本耐藥，給臨床抗感染治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。本研究中，昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院94株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性數(shù)據(jù)顯示，這些鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物廣泛耐藥，與文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道一致。對(duì)頭孢類、青霉素類和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達(dá)100.0%；對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲噁唑基本耐藥，耐藥率均超過(guò)90.0%，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米諾環(huán)素的耐藥率較高，分別為88.0%、87.5%和60.2%，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌只對(duì)替加環(huán)素保持高度敏感性，未檢測(cè)到耐藥菌株?？咕幬镏刑记嗝瓜╊惪咕幬锸强咕V廣、抗菌活性強(qiáng)的一類抗菌藥物，曾被作為是治療多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的首選藥物[6]，但從本研究得出的數(shù)據(jù)，碳青霉烯類的耐藥率已經(jīng)達(dá)到了100.0%。僅有新型抗菌藥物替加環(huán)素對(duì)其敏感性較高，但由于替加環(huán)素高昂的價(jià)格及其臨床療效不確定性，導(dǎo)致其并不能在臨床治療中廣泛使用。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，目前主要包括四方面：(1)產(chǎn)生抗菌藥物的相關(guān)酶類；(2)膜通道蛋白的缺失或滲透性下降；(3)外排泵的過(guò)度表達(dá)；(4)藥物作用靶位的改變[7-8]。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性常常是由其中一種或幾種機(jī)制共同作用而導(dǎo)致[9]。本研究所檢測(cè)的OXA-23和TEM分別屬于產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶中的D類酶苯唑西林酶和A 類超廣譜內(nèi)酰胺酶中最具代表性的酶類，同時(shí)OXA-23和TEM也屬于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中陽(yáng)性率最高的酶[10]。研究結(jié)果顯示檢測(cè)的94株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，攜帶OXA-23基因菌株為86株，未攜帶OXA-23基因?yàn)?株，OXA-23陽(yáng)性攜帶率為91.5%。根據(jù)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，亞胺培南耐藥率為100.0%，推測(cè)本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶OXA-23基因可能是導(dǎo)致亞胺培南耐藥的原因；而檢測(cè)TEM基因陽(yáng)性菌株為81株，未攜帶TEM基因的為13株，陽(yáng)性率為86.2%。結(jié)合其耐藥表型結(jié)果，推測(cè)本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中攜帶TEM基因可能是導(dǎo)致哌拉西林和頭孢類耐藥的原因。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)一線抗菌藥物頭孢類、青霉素類和碳?xì)涿瓜╊惪咕幬锏哪退幝室呀?jīng)達(dá)100.0%，耐藥情況嚴(yán)重。本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌多數(shù)攜帶OXA-23、TEM型耐藥基因，其耐藥基因與細(xì)菌耐藥表型基本一致。但是由于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，其余未攜帶OXA-23與TEM基因?qū)е碌哪退幙赡芘c其他耐藥機(jī)制有關(guān)，如膜通道蛋白的缺失或滲透性下，細(xì)胞外排泵過(guò)度表達(dá)等。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗菌藥物廣泛耐藥，且多數(shù)菌株攜帶OXA-23、TEM基因，其攜帶耐藥基因與耐藥表現(xiàn)基本一致。鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率不斷增長(zhǎng)，耐藥形勢(shì)日益嚴(yán)峻，臨床上必須做好鮑曼不動(dòng)桿菌的隔離及防護(hù)感控措施，并加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株的耐藥性監(jiān)測(cè)，才能減少耐藥菌株的產(chǎn)生。對(duì)于本地多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及耐藥基因的研究還在不斷的進(jìn)展中，課題組將繼續(xù)檢測(cè)其他耐藥基因，分析出耐藥基因在當(dāng)?shù)胤植剂餍星闆r，從而指導(dǎo)臨床及時(shí)、合理有效的用藥。