高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定五味子糖漿中7 種木脂素的含量

吳子靜，梁大虎，楊斌，謝海棠

作為著名的中藥，五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有滋陰養(yǎng)氣作用［1-2］?！缎滦薇静荨分杏涊d五味子果肉和果皮酸甜，而種子苦辣，一起食用，有咸、甜、酸、辛辣和苦味，所以五味子又被稱為“五味果”或“五味子”［3］。五味子是中國(guó)處方中常見成分，現(xiàn)收錄于2015 年版《中國(guó)藥典》第一部，并以五味子醇甲作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［4］。現(xiàn)代藥理研究表明，五味子含有木脂素［5］、揮發(fā)油［6］、有機(jī)酸［7］、維生素［8］、萜類［9］、多糖［10］等化學(xué)成分，但其大部分生物和藥理作用可歸因于其木脂素成分，含量高達(dá)8%，特別是二苯并環(huán)辛二烯型木脂素，可降低血清谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）水平，抑制血小板聚集，顯示出抗氧化，鈣拮抗，抗腫瘤和抗人類免疫缺陷病毒（HIV）等作用［11-12］。

五味子糖漿由五味子單味藥材組成，用于腎精不足，氣血虧虛引起的神經(jīng)衰弱、頭暈、失眠［13］。目前，關(guān)于五味子糖漿中木脂素的含量測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道，但只對(duì)其中一種或兩種木脂素成分含量進(jìn)行了測(cè)定，難以全面反映五味子糖漿中木脂素的質(zhì)量［14-16］，且文獻(xiàn)均采用高效液相色譜（HPLC）法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定五味子糖漿中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲這7種木脂素的分析方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)自2018年1月至2019年1月采用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定五味子糖漿中7 種木脂素成分的含量，該方法簡(jiǎn)便、快捷、可靠，為有效控制五味子糖漿產(chǎn)品質(zhì)量提供了方法。

1 儀器與試藥

API 3200質(zhì)譜儀，Analyst 1.6.2質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Shimadzu LC-20AD二元泵，SIL-HTc 自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10ASvp 柱溫箱（日本島津公司）；IKA-Werke Typ VX 2E型搖床（德國(guó)儀科公司）；METTLER TOLEDO ME55 微量分析天平；Millipore Direct-Q3 型純水儀（美國(guó)密理博公司）；高速離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］。

五味子醇甲（批號(hào)：110857-201211，含量：99.9%）、五味子甲素（批號(hào)：110764-201111，含量：99.3%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；五味子醇乙（批號(hào)：P28S6F3984，含量：98%）、五味子乙素（批號(hào)：P29J8F38066，含量：98%）、五味子丙素（批號(hào)：P28J8F36916，含量：98%）、五味子酚（批號(hào)：P13O8F45574，含量：98%）、五味子酯甲（批號(hào)：P13O8S45575，含量：98%）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯雙酯（批號(hào)：C10105842，含量：98%），購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；五味子糖漿均為藥店銷售的產(chǎn)品［上海海虹實(shí)業(yè)（集團(tuán)）巢湖今辰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170511，180203，180510］。乙酸銨分析純（上海四試赫維化工有限公司）；甲醇、甲酸為色譜純（德國(guó)默克公司）；水為去離子超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相：90%甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸銨），等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行定量分析。7種木脂素成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲對(duì)照品適量，用甲醇配制成濃度分別為1.22、0.45、1.16、0.58、0.51、0.54、0.53 g/L的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別得到五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲質(zhì)量濃度為40.00、9.02、5.00、11.64、5.13、5.40、5.26 mg/L 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；所有溶液均4 ℃保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取聯(lián)苯雙酯對(duì)照品適量，用甲醇溶解配制成濃度為0.73 g/L 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，用甲醇進(jìn)一步稀釋成濃度為500μg/L，作為內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密吸取五味子糖漿100μL，置10 mL 離心管中，用50%甲醇水稀釋100倍，超聲提取15 min，0.45μm 微孔濾膜連續(xù)過濾兩次，12 000 r/mim離心5 min，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定。在此色譜條件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲和聯(lián)苯雙酯的出峰時(shí)間分別為3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75、3.46 min?？瞻兹軇?、對(duì)照品及五味子糖漿供試品溶液的色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察及定量下限測(cè)定 甲醇稀釋上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，得到系列混合對(duì)照品的工作液。其中五味子醇甲的線性濃度為125.00、250.00、500.00、1 000.00、2 000.00 和4 000.00μg/L，五味子醇乙的線性濃度為28.18、56.35、112.70、225.40、450.80和901.60μg/L，五味子甲素的線性濃度 為15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 和500.00μg/L，五味子乙素的線性濃度為36.38、72.76、145.53、291.05、582.10和1 164.20μg/L，五味子丙素的線性濃度為16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50 μg/L，五味子酚的線性濃度為16.02、32.03、64.06、128.13、256.25 和512.50μg/L，五味子酯甲的線性濃度為16.45、32.89、65.78、131.57、263.13 和526.26μg/L，所有溶液均按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各分析物的峰面積AS和內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯雙酯的峰面積AIS，以AS與AIS的比值F為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，作加權(quán)線性回歸計(jì)算（權(quán)重系數(shù)為1/X2），五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的回歸方程、回歸系數(shù)等參數(shù)見表2。這7種木脂素的定量 限（LOQ）分 別 為125.00、28.18、15.63、36.38、16.02、16.88和16.45μg/L，信噪比S/N均大于10。

表1 7種木脂素成分的質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1 空白溶劑、對(duì)照品及五味子糖漿供試品色譜圖：A為空白溶劑；B為對(duì)照品；C為供試品

表2 7種木脂素成分線性范圍、回歸方程、檢測(cè)限和定量限

2.3.3 精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS 條件對(duì)同一混合對(duì)照品溶液（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲濃度分別為：1 000.00、225.40、125.00、291.05、128.13、135.00和131.57μg/L）重復(fù)進(jìn)樣6次，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚和五味子酯甲的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝6）分別為2.17%、2.01%、1.68%、1.47%、0.97%、1.19%和1.30%，說明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批五味子糖漿樣品6份（批號(hào)170511），按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得五味子糖漿中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲含量平均值分別為175.22、33.47、29.42、90.21、11.01、2.93、3.65 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝6）分別為2.10%、1.58%、2.26%、1.34%、1.74%、1.67%、2.32%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)170511），分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得五味子糖漿中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝8）分別為1.61%、2.06%、1.44%、1.53%、2.10%、1.62%、0.97%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取9份已知7種木脂素含量的五味子糖漿（批號(hào)170511），按7種木脂素含量的80%、100%、120%添加混合對(duì)照品溶液后按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，每種比例各配制3份，按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測(cè)定 精密量取3個(gè)批號(hào)的五味子糖漿（批號(hào)170511、180203，180510）各6份，按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下HPLC-MS/MS條件進(jìn)行測(cè)定，各批號(hào)五味子糖漿中7種待測(cè)物含量結(jié)果見表4。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 7種木脂素成分含有量測(cè)定結(jié)果/（mg/L，n＝6）

3 討論

3.1 色譜質(zhì)譜條件的確定

3.1.1 色譜條件的確定 參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)并結(jié)合待測(cè)物的物理化學(xué)性質(zhì)，考察了3種色譜柱Agilent Zorbax SB-C18（50 mm×3.0 mm，3.5μm）［17］、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）［18］和Waters ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm）［19］，以比較色譜峰峰形、分離度；對(duì)于流動(dòng)相的選擇，首先考察了乙腈-水和甲醇-水兩種體系，結(jié)果表明與乙腈-水體系相比甲醇-水體系分離度更好，然后考察甲醇-水體系下加入甲酸、乙酸銨等酸的影響；同時(shí)還考察了流速、柱溫和不同進(jìn)樣量，結(jié)果表明當(dāng)流速為0.5 mL/min、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量為10μL時(shí)，五味子中7種待測(cè)物的色譜峰峰形較好，可以與周圍干擾物質(zhì)達(dá)到良好的基線分離。所以最后確定采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱，90%甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸，5 mmol乙酸銨）系統(tǒng)，流速為0.5 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10μL。7種木脂素在此色譜條件下的出峰時(shí)間分別為3.94、4.38、6.30、8.17、9.78、5.16、4.75 min。

3.1.2 質(zhì)譜條件的確定 本實(shí)驗(yàn)分別將各待測(cè)分析物及內(nèi)標(biāo)配制成5 mg/L的溶液，用于注射泵連續(xù)進(jìn)樣，以優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。采用電噴霧電離源（ESI），多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行定量分析，并比較了正離子和負(fù)離子模式下離子峰強(qiáng)度，結(jié)果表明正離子條件下離子峰更穩(wěn)定、強(qiáng)度最好。在正離子模式下，根據(jù)先前選定的母離子、子離子，組成離子對(duì)，做MRM掃描，分別優(yōu)化DP、EP、CE、CXP等參數(shù)。

3.2 小結(jié) 五味子在我國(guó)已有幾千年的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》將五味子列為上品。近年來(lái)五味子及含有五味子的復(fù)方制劑應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但查閱五味子糖漿中木脂素含量測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)只對(duì)其中一種或兩種木脂素成分含量進(jìn)行了測(cè)定，難以全面反映五味子糖漿中木脂素的質(zhì)量。本研究采用HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定五味子糖漿中7種木脂素成分的含量。

2015年版《中國(guó)藥典》第一部五味子糖漿“含量測(cè)定”項(xiàng)下規(guī)定，每l mL 五味子糖漿含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）計(jì)，不得少于0.12 mg。由含量測(cè)定結(jié)果可以看出3 批五味子糖漿（批號(hào)：170511、180203、180510）中五味子醇甲的含量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酚、五味子酯甲在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.995），加樣回收率在92.41%～100.94%之間，該HPLC-MS/MS 方法可在11 min內(nèi)快速分離檢測(cè)出五味子糖漿中的7種木脂素成分，方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可為五味子糖漿的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。