HPLC-ELSD法測定玉液消渴顆粒中黃芪甲苷的含量

趙俊蘋，秦 穎，郝美玲

(1.呼和浩特市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.巴彥淖爾市食品藥品檢驗所，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015100；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

玉液消渴顆粒收載于部頒標準成方制劑[1]，處方由黃芪、葛根、山藥、知母、天花粉、雞內(nèi)金、五味子、太子參八味藥組成，具有益氣滋陰的功效，用于糖尿病消渴乏力，口渴多飲，多尿癥。部頒標準中只收載了性狀和檢查項，無含量測定項，標準簡單，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，文獻報道[2-3]，黃芪具有補氣、利水、固表止汗、生津養(yǎng)血、形滯通庳、托毒排膿等作用，是補氣的良藥，在玉液消渴顆粒中屬君藥，處方用量較大，所以首先考慮以黃芪的主要成分黃芪甲苷作為定量質(zhì)控指標進行研究，目前收集到兩個廠家共六批次樣品，其中一個廠家采用部頒標準檢驗，另一個廠家注冊時增訂了黃芪甲苷的含量測定，采用雙波長薄層掃描法測定[4]，此法費時，操作繁瑣，方法檢測靈敏度低，測定的數(shù)據(jù)誤差較大，質(zhì)量可控性差，參照《中國藥典》2015年版一部玉屏風顆粒含量測定項下方法[5]，采用HPLC-ELSD法對玉液消渴顆粒中的黃芪甲苷含量進行實驗摸索，經(jīng)方法學考察驗證后，陰性對照沒有干擾，方法準確，可靠，用于有效控制玉液消渴顆粒的質(zhì)量是可行的。

1 材料

1.1 儀器

島津20A液相色譜儀(檢測器:Alltech-ELSD6000);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器；Sartorius電子天平。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201515，供含量測定用，純度以93.0%計);玉液消渴顆粒(陜西君碧莎制藥有限公司，批號20160401、20160802、20201202、20201203)，沈陽飛龍藥業(yè)有限公司，批號：20151204、20151205)；甲醇、正丁醇、氨水為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)，柱溫：30℃，流動相：乙腈∶水(32∶68)，流速：1.0mL/min，檢測器漂移管溫度：108℃，載氣流量2.8L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

取裝量差異項下的本品，研細，取約15g，精密稱定，置索氏提取器中，加入甲醇冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流至提取液無色(約6小時)，提取液回收溶劑至干，殘渣加水20mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，合并氨試液并用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20mL，棄去氨試液，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備

取本藥處方中除黃芪外的其他藥材，按玉液消渴顆粒的制備工藝制成顆粒，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1線性關(guān)系考察

取黃芪甲苷對照品2.732mg(純度93.0%)，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻(含黃芪甲苷0.2540mg/mL)，精密吸取5μL、10μL、15μL、20μL、30μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定,以對照品溶液濃度的自然對數(shù)(X)對峰面積的自然對數(shù)(Y)進行回歸分析，回歸方程為： Y=1.626X+12.597 r = 0.9992，結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.270μg～7.622μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2專屬性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，陰性對照溶液無干擾，黃芪甲苷峰和相鄰雜峰良好分離，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算大于10000。色譜圖見圖1、圖2、圖3。

2.3.3精密度試驗

精密吸取2.2.1中對照品溶液20μL，重復進樣5次，測得黃芪甲苷峰面積RSD為1.1%。表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實驗

精密吸取供試品溶液，分別于0h、2h、4h、7h、9h、11h、14h進樣20μL，測定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果黃芪甲苷峰面積積分值RSD為1.6%，表明供試品溶液在14小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復性試驗

精密稱取同一批供試品(批號：20160401)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為0.096mg/g，RSD為1.1%，表明本方法重復性好。

2.3.6加樣回收試驗

取已知含量的同一供試品(批號20160401，含黃芪甲苷0.096mg/g)9份，各約7.5g，精密稱定，置索氏提取器中，按低、中、高濃度黃芪甲苷對照品加入量與所取供試品中黃芪甲苷量之比約0.5∶1、1∶1、1.5∶1，分為3組，分別加入黃芪甲苷對照品溶液(黃芪甲苷對照品溶液濃度0.3925mg/mL,純度93.0%)1.0mL、2.0mL、3.0mL，加甲醇浸泡過夜，再加甲醇適量，加熱回流至提取液無色(約6小時)，提取液回收溶劑至干，殘渣加水20mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次……以下提取方法同“2.2.2供試品溶液制備法”……取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件測定，進樣20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果平均回收率為93.5%，RSD為2.2%。

2.3.7樣品含量測定

取四批樣品按“2.2.2”項下方法制備，并按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，每批樣品取兩份樣，計算含量，取其含量平均值，結(jié)果見表1：

表1 樣品中黃芪甲苷含量測定結(jié)果(n=2)

2.3.8耐用性試驗

取同一供試品溶液(“2.3.5”項下的1號和2號樣液)按“2.1”項下色譜條件，對Agileng C18(250×4.6mm,5μm)柱和PhenomenexC18(250×4.6mm,5μm)柱進行比較，結(jié)果，如表2：

表2 不同色譜柱的耐用性試驗

3 討論

3.1 提取方法和時間的考察

在供試品提取方法中，用甲醇超聲處理和加熱回流提取樣品，結(jié)果超聲處理后的供試品溶液在放置過程中有絮狀沉淀，無法測定，故采用回流提取方法處理樣品。

供試品在加熱回流提取時，采用直接加熱回流2小時、3小時、4小時以及索氏回流提取(約6小時)進行考察，索氏提取測得含量略偏高，又考慮到索氏提取效率更高，故選擇索氏回流提取。

參照中國藥典一部[5]一些成方制劑，黃芪甲苷的提取方法都比較繁瑣，為了能簡化提取方法，在實驗摸索的過程中，參照中國藥典2020年版一部[6]黃芪藥材黃芪甲苷測定項下，供試品溶液的制備采用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液進行加熱回流提取，結(jié)果供試品溶液粘稠，影響測定，考慮到玉液消渴顆粒為復方制劑，藥味多，制作時有大量輔料添加，故此法不宜。

查閱相關(guān)文獻資料[7]，黃芪甲苷屬于三萜皂苷，極性較大，難溶于丙酮、乙醚，在含水正丁醇中有較大的溶解性，針對黃芪甲苷的含量測定已有一些研究[8-9]，所以經(jīng)過試驗，用水飽和的正丁醇進一步提取黃芪甲苷是較好的選擇。

3.2 漂移管溫度和載氣流速的考察

基于蒸發(fā)光散射檢測器的特點，漂移管的溫度和載氣流速對基線的穩(wěn)定和峰面積影響較大，通過對漂移管分別為101.6℃、103℃、105℃、108℃四個溫度時，載氣流速分別為2.7L/min和2.8L/min之間進行試驗考察，發(fā)現(xiàn)漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8L/min時，峰面積值穩(wěn)定，基線平穩(wěn)，所以最終確定漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8L/min。