PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于南疆維吾爾族成人齲病、牙周炎口腔微生物多樣性的研究

代海濤，仵楠，徐江，唐小雪，余芯樂，李艷，，崔靈欣

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子，832008；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子，832008)

齲病與牙周炎的臨床表現(xiàn)及疾病進程迥異，但都可以導(dǎo)致牙齒缺失[1]。長期以來這兩種疾病常被獨立研究[2]，普遍認(rèn)為齲易感者容易發(fā)生牙周炎，但事實并非如此。研究發(fā)現(xiàn)很多牙周狀況較好的人確是齲敏感人群，而很多重度牙周炎患者，齲齒的患病率卻很低，齲病和牙周炎的發(fā)生之間好似存在著相互抗衡的關(guān)系[3]。齲病與牙周炎均有明顯的地區(qū)差異性和民族差異性[4]，這也受到很多研究者的關(guān)注。新疆維吾爾民族與漢族在外部身材相貌，內(nèi)部體格素質(zhì)上有很大區(qū)別。南疆地區(qū)第三師51團固定人口5萬余人，98.5%以上為維吾爾族，是維吾爾民族聚居區(qū)，生活飲食習(xí)慣遵從伊斯蘭教風(fēng)俗，生活區(qū)域較穩(wěn)定，生活方式較單一，口腔保健意識及口腔醫(yī)療干預(yù)幾乎為零。故為本課題組研究維吾爾族口腔微生物多樣性提供了特色又穩(wěn)定的研究背景。有研究認(rèn)為維吾爾族人牙周病、齲病發(fā)生率均較高[5]。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),南疆維吾爾族人群患齲率高而牙周炎的患病率較低，且兩者存在相互拮抗的現(xiàn)象，目前的研究很少涉及兩者的發(fā)生環(huán)境與之相關(guān)性[6]。垂直凝膠電泳技術(shù)(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)在環(huán)境微生物多樣性的研究中被廣泛采用，具有操作方便快捷，可以批量操作、重復(fù)驗證、價格適宜等優(yōu)點。本研究從符合納入標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)查人群中篩查出高齲無牙周炎人群與無齲重度牙周炎組人群，通過PCR-DGGE技術(shù)分析該民族兩組人群口腔微生物種類特點，從微生物角度了解這2種疾病有何關(guān)聯(lián)，分析這2種疾病的發(fā)生機制，為預(yù)防及治未病提供新途徑。

1 資料與方法

1.1 研究對象

針對南疆第三師51團采取隨機抽樣原則抽取309戶居民，以家庭成員中35～50歲成人為研究對象，按照以下口腔檢查方法分組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)南疆三代及以上常駐居民，無長期異地居住史；(2)無系統(tǒng)性疾病、慢性疾病以及先天性疾??；(3)口腔除齲病和牙周炎以外無其他疾病，牙齒結(jié)構(gòu)及發(fā)育無異常；(4)口腔中無大面積修復(fù)體；(5)最近1個月內(nèi)無抗生素及其它藥物使用史；(6)非妊娠期或哺乳期。

1.2 口腔檢查方法

參考《第四次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查方案》，3名口腔醫(yī)師(標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗kappa>0.90)用牙周探診及雙頭探針行牙周炎及齲病檢查，記錄患者齲失補牙數(shù)(decay missing fill,DMFT)。根據(jù)齲敏感程度[7]，分為無齲組(DMFT=0、低齲組(0

1.3 樣本采集

研究對象晨起10∶00采集樣本，之前用PBS液漱口30 s。用滅菌5 mL EP管收集研究對象自然排出的唾液2 mL，-4 ℃標(biāo)記轉(zhuǎn)運保存，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA提取16S V3區(qū)擴增及檢測

從健康組中抽取20例樣本(N0組)，高齲無牙周炎組中抽取10例樣本(N1組)，無齲重度牙周炎組中抽取10例樣本(N2組)。各取3 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。16S V3區(qū)擴增引物357S-GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC- GGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；518R:ATTACCGCGGCTGCTGG[10]，PCR反應(yīng)體系(40 μL)：2×Mix20 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，補ddH2O至40 μL。循環(huán)條件：94 ℃熱啟動2 min；94℃30 s，55 ℃退火30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；72℃5 min。10 ℃保存[10]。Recondition PCR(5個循環(huán))。1.50%瓊脂糖，1×Tris-硼酸電泳緩沖液，電泳(120 V)30 min，核酸電泳染色。紫外線凝膠掃描成像，記錄結(jié)果。

1.5 PCR-DGGE變性凝膠電泳圖譜分析

1.5.1 變性膠的制備

變性劑濃度52%～65%((100%變性濃度為：7 M Urea，40% Formamide)，Bio-Rad Model475 Gradient Delivery System 灌膠系統(tǒng)以從頂部注入凝膠的填充方式進行梯度灌膠。

1.5.2 電泳及染色

凝固膠加樣后，電壓70 V，水浴溫度60 ℃，電泳時間15.5 h。Biolinker DNA Red 染色液染色 40 min。

1.5.3 DGGE膠條帶分析

染好的膠通過Bio-Rad 凝膠成像儀進行拍照，采用Quantity One分析軟件(Bio-Rad),統(tǒng)計條帶數(shù)，選用多維定標(biāo)分析，非加權(quán)平均數(shù)(UPGMA,unweighted-pair group method arithmeticmean)對DGGE圖譜進行聚類分析。

1.6 回收條帶、克隆測序及BLAST分析

將DGGE膠上回收的條帶膠4 ℃保存12 h，取3 μL為模板再次擴增，PCR擴增產(chǎn)物克隆測序。通過 NCBI- BLAST軟件對所得序列進行分析，獲得細菌的鑒定結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行分析。采用χ2檢驗對納入人群患齲率、慢性牙周炎患病率流行病學(xué)統(tǒng)計，采用方差分析及多重檢驗比較N0組、N1組、N2組PCR-DGGE條帶數(shù)差異，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 納入對象基本情況

本調(diào)查655名維吾爾族成年人群符合納入標(biāo)準(zhǔn)的人為635人(無牙頜20例除外)(表1)。南疆第三師51團成年人齲病和牙周健康基本狀況齲為5.12±2.07，患齲率為 92.28%；慢性牙周炎患病率為38.11%。高齲無牙周炎組與無齲重度牙周炎組流行病學(xué)分布有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=9.277，P=0.000*)。

表1 南疆第三師51團維吾爾族35～50歲成年人齲病、牙周炎流行病學(xué)分布

2.2 16SV3區(qū)特征片段PCR結(jié)果

Reconditioning PCR擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果確認(rèn) N0組、N1組、N2組各樣本的目的片段在250 bp，濃度適中(圖1、圖2)。

注：MarkerDL2000，其中亮帶為20 ng/μL，其余為10 ng/μL。1-10為N1組樣本，11-20為N2組樣本圖1 N1組、N2組16S V3區(qū)PCR檢測電泳圖

注：MarkerDL2000，其中亮帶為20 ng/μL，其余為10 ng/μL。1-20為健康組樣本圖2 N0組16S V3區(qū)PCR檢測電泳圖

2.3 PCR-DGGE變性凝膠電泳圖譜分析

PCR-DGGE凝膠電泳條帶清晰。N0組20例健康人群標(biāo)本DGGE圖譜條帶計數(shù)總數(shù)為941條，平均數(shù)為46.90±2.53。N1組細菌條帶技數(shù)總數(shù)為342條，平均為34.40±1.50。N2組細菌條帶技數(shù)總數(shù)為294條，平均為29.90±3.14,方差分析多重檢驗比較發(fā)現(xiàn)各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000*)(圖3、圖4)。

圖3 N0組PCR-DGGE檢測電泳圖

圖4 N1組、N2組PCR-DGGE檢測電泳

2.4 健康組、高齲無牙周炎組與無齲重度牙周炎組微生物群落樣品間的聚類分析

由Quantity One軟件的非加權(quán)組平均法(UPGMA)所產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹，其代表樣品之間相似關(guān)系，通過該樹可以直觀的看到樣品之間的相似性關(guān)系。

從圖5中可以直觀的看到N0組、N1組、N2組樣本組內(nèi)相似性較高(N1組樣本1-10，N2組樣本11-20,N0組樣本為31-40)，N0組與N1組、N2組之間的相似性較低，相似系數(shù)為0.05。

注：發(fā)育樹中數(shù)值表示各樣品之間的相似系數(shù)樹枝末尾表示各樣品編號圖5 利用UPGMA方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

2.5 選取PCR-DGGE條帶基因片段的測序分析

選取N1組樣本1、2、3、4；N2組樣本11、17、18、19；N0組樣本31、33、35、36共12個樣本經(jīng)過切膠回收，克隆測序，BLAST檢索條帶序列和同源性比較后可以確定條帶所代表的菌群,在GeneBank查詢菌種。

N0組樣本31、33、35、36中菌群成分相似，比例均衡，除bacteriodales所占比例較高以外，其余菌種較為平衡。N1組樣本1、3、5、7樣本以Streptococcaceae、Prevotellaceae、Lactobacillales、Veillonellaceae、Flavobacteriaceae為主，較N0組Veillonellacea、Flavobacteriacea、Prevotellaceae、Lactobacillales所占比例明顯增高，而Streptococcaceae比例從1%～20%，分布不均勻。N2組樣本11、17、18、19中Porphyromonadaceae、 Unclassfiled、 Leptotrichosis、Spirochaetaceae、Fusobacteriaceae為主，較N0組Porphyromonadaceae、 Unclassfiled、 Leptotrichosis、Spirochaetaceae、Fusobacteriaceae所占比例明顯增高，但Lactobacillales比例明顯下降(圖6)。

3 討論

牙周炎與齲病在世界各國發(fā)病率都較高，齲病被認(rèn)為是世界第三大疾病，重度牙周炎更是給牙齒判了死刑。齲病與牙周炎都可以導(dǎo)致牙齒缺失，但兩者發(fā)病特點和病損組織狀態(tài)卻大不相同。有研究認(rèn)為細菌與宿主在外界環(huán)境變化時，口腔微環(huán)境平衡失調(diào)，微生物間此消彼長使得某些致病微生物占優(yōu)勢而致病[11-13]，以往研究認(rèn)為齲病多與變形鏈球菌、乳酸桿菌有關(guān)[14-15]，牙周炎多與牙齦卟啉單胞菌等有關(guān)，長期以往對抗優(yōu)勢菌的治療并未在防控齲齒及牙周炎上取得明顯成效。而對于牙周炎與齲病的研究也常常被獨立開來，兩者之間是否存在協(xié)同相關(guān)、相互拮抗或者毫無關(guān)系等的流行病學(xué)和細菌學(xué)關(guān)系研究還鮮有報道。

微生物群落會受宿主的種族、生活環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活方式的影響而變化。維吾爾族人群整體面貌偏向于歐羅巴人種，飲食習(xí)慣、生活方式獨具特色。本研究選擇生活環(huán)境較為封閉的南疆維吾爾族傳統(tǒng)世居的35～50歲維吾爾成年人635名，經(jīng)調(diào)查齲均為5.12±2.07，患齲率為 92.28%，明顯高于全國平均水平82%[10]；慢性牙周炎患病率為 38.11%，低于全國平均水平54%[16]。高齲無牙周炎組與無齲重度牙周炎組流行病學(xué)分布存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=9.277，P=0.000)。本次研究發(fā)現(xiàn)，該人群普遍口腔衛(wèi)生意識淡薄，能保障每日兩次刷牙口腔保健的人微乎其微，牙菌斑、軟垢及牙結(jié)石的檢出率極高。從這一方面可以解釋該因素是齲病患病率高，但牙周炎與齲病的發(fā)生不僅不是協(xié)同相加的關(guān)系，相反，牙周炎重的患者齲齒的患病率很低，而齲齒患病率高的患者牙周炎的患病率很低，兩種疾病存在著負性關(guān)系，這與很多研究結(jié)果相反[17]?？谇恢形⑸飻?shù)量眾多，牙周炎患者與齲病患者口腔中微生物群構(gòu)成是否有明顯不同，兩組菌群構(gòu)成的趨向性和相互關(guān)系在目前國際國內(nèi)還沒有深入的研究。

Reconditioning PCR是指稀釋原PCR產(chǎn)物至0.1倍，依照PCR原本反應(yīng)體系，再次重復(fù)進行PCR擴增，與原PCR不同之處在于此次擴增僅需5個循環(huán)。在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的異源雙鏈對PCR-DGGE圖譜的觀察和分析會有很大干擾，而通過Reconditioning PCR可以有效清除異源雙鏈。PCR-DGGE分析方法是一種較實用的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)，可以在一條泳道上分離出序列不同明暗強度不一的DNA條帶，因此可以直觀觀察到微生物的豐富性，以及觀察條帶的明暗度反應(yīng)微生物數(shù)量占比。v3區(qū)、v1-v3區(qū)、v6-v8區(qū)[18-19]在16Sr DNA中屬于保守區(qū)域片段,多種微生物菌群的研究均采用。通過細菌16SrDNA可變區(qū)PCR,擴增產(chǎn)物通過DGGE可以顯示出不同的條帶,所以可以用 PCR-DGGE的方法進行區(qū)別。

本課題通過擴增16SrDNA V3可變區(qū),應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù),將健康組、高齲無牙周炎組與無齲重度牙周炎組3組人群唾液DNA中分離出多條電泳條帶，且條帶清晰明亮。健康組條帶數(shù)明顯多于其他兩組，說明健康組口腔中微生物含量更為豐富，而其他兩組口腔群落結(jié)構(gòu)相對單一，這種結(jié)果可能與口內(nèi)菌群平衡被打破時，有些細菌被替換導(dǎo)致缺失引起。關(guān)于健康組口腔微生物的研究比較廣泛，而高齲無牙周炎組與無齲重度牙周炎組條帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計也存在明顯差異，且這兩組疾病人群口腔菌群的相互關(guān)系研究還很少見，故而本研究僅對兩疾病組人群進行微生物分析。

生態(tài)學(xué)中許多物種或環(huán)境因子常常是是離散非連續(xù)性的，但許多統(tǒng)計學(xué)模型和計算方法往往是針對連續(xù)線性的模型。為了讓非對稱的物種數(shù)據(jù)可以用這些線性的統(tǒng)計模型，需要將數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化。聚類分析也是需要先進行轉(zhuǎn)化的。UPGMA可以用于分析分類問題，屬于平均聚合聚類，是微生物多樣性分析中常用的聚類分析方法。UPGMA最早是用來解決分類問題的。當(dāng)用來重建系統(tǒng)發(fā)生樹時其主要依據(jù)是聚到同一個數(shù)據(jù)集中的樣本，將個體或者變量按相似程度劃分類別，使得同一類中的元素之間的相似性比其他類的元素的相似性更強。目的在于使類間元素的同質(zhì)性最大化和類與類間元素的異質(zhì)性最大化。

本研究應(yīng)用UPGMA方法計算遺傳相似系數(shù)并做聚類圖分析，結(jié)果顯示健康組、高齲無牙周炎組、無齲重度牙周炎組人群組內(nèi)相似系數(shù)較高，而健康組人群與其它兩組人群組間相似系數(shù)僅為0.05，由此可以推斷口腔疾病狀態(tài)下微生物構(gòu)成會發(fā)生重大變化。將分別屬于同組且相似度較高的1、2、3、4、11、17、18、19、31、33、35、36樣本PCR-DGGE產(chǎn)物回收、克隆、測序研究菌種之間的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康組中除bacteriodales所占比例較高以外，其余菌種較為均衡，而bacteriodales正常寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道中。高齲無牙周炎樣本中以Streptococcaceae、Prevotellaceae、Lactobacillales、Veillonellaceae、Flavobacteriaceae為主，較健康組Veillonellacea、Flavobacteriacea、Prevotellaceae、Lactobacillales所占比例明顯增高，而Streptococcaceae并不是像以往研究那樣占據(jù)絕對優(yōu)勢地位[14]，其比例從1%～20%，分布不均勻。Streptococcaceae在無齲重度牙周炎組中也廣泛存在，但比例偏低，也反向證明了Streptococcaceae與齲病呈正相關(guān)關(guān)系，但齲病的發(fā)生并不是由單一菌種導(dǎo)致，而是通過整個菌群結(jié)構(gòu)改變所致。本研究發(fā)現(xiàn)Veillonellaceae、Flavobacteriaceae在高齲無牙周炎組中比例較高，在無齲重度牙周炎組中比例較低，推測Veillonellaceae、Flavobacteriaceae與齲病有正相關(guān)關(guān)系，這在以往的研究中少有提及。無齲重度牙周炎組樣本以Porphyromonadaceae、 Unclassfiled、 Leptotrichosis、Spirochaetaceae、Fusobacteriaceae為主，較健康組Porphyromonadaceae、 Unclassfiled、 Leptotrichosis、Spirochaetaceae、Fusobacteriaceae所占比例明顯增高，但Lactobacillales比例明顯下降。Lactobacillales被認(rèn)為是主要致齲菌，在高齲組中比例增高與很多研究一致[15]，但在無齲牙周炎組中比例減少，也提示Lactobacillales可能是牙周組織健康的有益菌，這點并未在中外文獻中查及。Porphyromonadaceae、Fusobacteriaceae一直以來都被認(rèn)為是牙周炎的主要致病菌，與本次研究相符，但Unclassfiled在樣本中比例較高，推測Unclassfiled在牙周炎中亦起到了重要作用，但在以往的文獻中未能查及，這可能與研究方法有關(guān)。這些優(yōu)勢菌在唾液微生態(tài)環(huán)境起著什么作用有待進一步研究，菌種之間的相互制約或促進作用以及通過微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用，能否逆轉(zhuǎn)這種平衡從而達到防治齲病，牙周炎正是研究的熱門和重要落腳點。

結(jié)合目前的文獻以及本研究結(jié)果可以看出不同健康狀態(tài)下口腔牙菌斑中的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性具有較大的差異，菌群之間具有相當(dāng)大的聯(lián)系與區(qū)別，這也說明了口腔菌群與疾病有密切關(guān)系，菌群復(fù)雜性遠超過優(yōu)勢菌群理論。PCR-DGGE技術(shù)可以批量研究多個樣本的菌種，對大樣本定性研究有絕對優(yōu)勢，但不能對各菌種定量，只能大概估計菌種構(gòu)成比。后期課題組將針對樣本進一步研究所測到的菌種數(shù)量的差異，微生物結(jié)構(gòu)差異性進行研究，探討細菌群落與疾病發(fā)展的關(guān)系，為口腔疾病防治提供微生物學(xué)身份信息。