翡翠貽貝酶解液體外降壓活性評價方法研究

安婷婷 王鶴 鄧長春 林資政

摘要?[目的]研究翡翠貽貝酶解液的體外降壓活性，為后期開發(fā)藥品和保健食品等提供前期的理論和試驗基礎(chǔ)。[方法]采用反向高效液相色譜法檢測翡翠貽貝酶解液的體外降壓活性。色譜柱：YMC?C18柱（250?mm×4.6?mm，5?μm）;流動相：A為0.1%TFA乙腈，B為0.1%TFA水;測定波長228?nm;流速1?mL/min;進(jìn)樣量20?μL。[結(jié)果]該方法使翡翠貽貝降血壓肽、HHL和馬尿酸較好地分離，在0.02～0.20?mg/mL線性關(guān)系良好（R2=?0.997?2），最低檢出限為50?ng，定量限為200?ng，平均回收率為101.87%。[結(jié)論]該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于評價翡翠貽貝降血壓肽的體外活性。

關(guān)鍵詞?翡翠貽貝酶解液;反相高效液相色譜法;體外;降壓活性

中圖分類號?TQ914.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0219-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.062

Study?on?the?Method?for?Evaluating?the?Antihypertensive?Activity?of?the?Enzymatic?Hydrolysate?of?Perna?viridis?in?vitro

AN?Tingting，WANG?He，DENG?Changchun?et?al

（Pharmaceutical?Institute?of?Hainan?Province，Haikou，Hainan?570311）

Abstract?[Objective]?The?research?aimed?to?study?the?antihypertensive?activity?of?the?emerald?mussel?enzymatic?hydrolysate?in?vitro，?and?to?provide?the?theoretical?and?experimental?basis?for?the?early?development?of?drugs?and?health?foods.[Method]The?RPHPLC?method?was?established?for?determining?the?activity?of?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis?in?vitro.It?was?analyzed?by?HPLC?on?a?YMC?C18?colunm（250?mm×4.6?mm，5?μm）?and?detected?at?the?wavelength?of?228?nm;mobile?phase：?A?was?0.1%?TFA?acetonitrile，?B?was?0.1%?TFA?water;the?velocity?of?flow?was?1.0?mL/min?and?sample?size?was?20?μL.[Result]This?method?could?separate?the?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis，HHL?and?hippuric?acid?well.?There?was?perfect?linear?correlation?between?0.02-0.20?mg/mL（R2=?0.997?2）.?The?detection?limit?was?50?ng?and?the?limit?of?quantitation?was?200?ng.The?average?recovery?rate?was?101.87%.[Conclusion]The?method?is?simple，?rapid?and?sensitive.?It?can?be?used?to?evaluate?the?enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis?activity?in?vitro.

Key?words?Enzymatic?hydrolysate?of?Perna?viridis;RPHPLC?method;in?vitro;Antihypertensive?activity

基金項目?海南自然科學(xué)基金面上項目（817201）。

作者簡介?安婷婷（1982—），女，河北新樂人，高級工程師，碩士，從事新藥研發(fā)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立、海洋藥物方面研究。

收稿日期?2019-10-12

高血壓是一種危險的多發(fā)病，同時它又是動脈硬化、冠心病、心臟及腎臟功能衰竭的最主要的致病因素，全球患高血壓人數(shù)已超過5?億。目前，普遍采用治療高血壓的藥物都是化學(xué)合成藥物，長期服用會產(chǎn)生各種副作用，故醫(yī)務(wù)人員與患者更青睞于非化學(xué)合成藥物療法[1-2]。降血壓肽又稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（angiotensin?converting?enzyme?inhibitory?peptides，簡稱ACEIPs），其通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成以及抑制血管舒緩激肽的分解而達(dá)到降血壓的作用[3]。Je等[4]從發(fā)酵貽貝中分離到顯著活性的降血壓肽。

翡翠貽貝（Perna?viridis（Linnaeus）），又名綠殼菜蛤、淡菜或青口螺，廣泛分布于東海南部和南海，容易人工養(yǎng)殖，繁殖能力很強(qiáng)，產(chǎn)量高。翡翠貽貝肉風(fēng)味獨特，牛磺酸的含量豐富[5]，富含DHA、EPA[6]、糖胺聚糖[7-9]，具有特殊的類似于蠔的香味，中醫(yī)認(rèn)為翡翠貽貝性溫，能補(bǔ)五臟、理腰腳、益陽事、調(diào)經(jīng)活血，是重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。翡翠貽貝酶解液為翡翠貽貝經(jīng)過一系列酶解產(chǎn)生的、含有大量的降血壓肽，該研究主要開發(fā)一套適合翡翠貽貝酶解液的體外活性評價方法，為后期開發(fā)藥品和保健食品等提供前期的理論和試驗基礎(chǔ)，也為開發(fā)海南的經(jīng)濟(jì)貝類作出貢獻(xiàn)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?研究對象。翡翠貽貝酶解液，海南省藥物研究所自制。

1.1.2

主要儀器。高效液相色譜儀（島津，HPLC-2010AHT）;循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-95）;超聲微波清洗儀（SK450HP）;臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16MC）。

1.1.3

主要試劑。馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL，SIGMA，美國）;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，上海源葉生物科技有限公司）;馬尿酸（140738-200501，中檢所）;乙腈（HPLC級）;三氟乙酸（TFA，HPLC級）;純化水為海南省藥物研究所自制;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2?方法

1.2.1?對照品溶液的制備。精密稱取馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品40?mg，用超純水稀釋，定容至100?mL容量瓶中，配制成0.4?mg/mL馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2

供試品溶液的制備。80?μL?5?mmol/L?HHL與30?μL翡翠貽貝酶解液均勻混合，加入30?μL的0.1?mol/L硼酸鹽緩沖液（pH?8.3，含0.3?mol/L?NaC1），混勻，加入10?μL?0.1?U/mL?ACE溶液，37?℃下水浴反應(yīng)35?min，反應(yīng)完成后加入150?μL?1?mol/L?HCl溶液中止反應(yīng)，離心，為供試品溶液。

1.2.3

色譜分析條件。色譜柱：YMC?C18（250?mm×4.6?mm，5?μm）;流動相：A為0.1%TFA乙腈，B為0.1%TFA水，流動相時間程序如表1所示;檢測波長228?nm[10-11];流速1.0?mL/min;進(jìn)樣量20?μL。

1.2.4?方法學(xué)考察。

1.2.4.1

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。分別吸取對照品溶液、供試品溶液、5?mmol/L?HHL溶液、空白（硼酸鹽緩沖液）各20?μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2?線性關(guān)系的考察。將馬尿酸對照品溶液用純水稀釋制成每1?mL含0.02、0.04、0.06、0.08、1.00、1.20?mg的系列溶液，分別吸取20?μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.3

檢測限和定量限的考察。將馬尿酸對照品溶液逐步稀釋后進(jìn)樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進(jìn)樣量為最低檢測限（LOD），S/N為10時的進(jìn)樣量為最低定量限（LOQ）。

1.2.4.4?穩(wěn)定性試驗。取同一供試樣品溶液，按“1.2.3”色譜分析條件分別于0、0.5、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0?h進(jìn)樣，進(jìn)樣量20?μL，測定峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.5?精密度試驗。取按“1.2.1”方法制備的馬尿酸對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計算峰面積的RSD值。

1.2.4.6

加樣回收試驗。取同一批次的翡翠貽貝酶解液分為9份，每3份分別加入10、20、30?μL?0.4?mg/mL馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測定，進(jìn)樣量為20?μL，測定峰面積，計算平均回收率和RSD。

2?結(jié)果與分析

2.1?系統(tǒng)適應(yīng)性試驗?圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，馬尿酸的保留時間為15.990?min，HHL出峰保留時間為27.064?min，且在供試品溶液中分離度均大于1.5。由此可見，此色譜條件下能夠分離供試品中的各個物質(zhì)。

2.2?線性關(guān)系的考察

按“1.2.4.2”方法操作，峰面積分別為1?256?896、2?594?000、4?327?563、5?740?945、6?901?320、13?246?812，以進(jìn)樣濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，計算得線性回歸方程為Y=7E+07X+151?856（R2=0.997?2），表明馬尿酸在0.02～0.20?mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.3?檢測限和定量限的考察?按“1.2.4.3”方法操作，結(jié)果表明，馬尿酸的檢測限和定量限分別為50和200?ng。

2.4?穩(wěn)定性試驗?按“1.2.4.4”方法操作，峰面積分別為2?275?842、2?236?815、2?269?853、2?206?398、2?296?442、2?230?150、2?215?963，計算得出平均峰面積為2?247?352，峰面積積分值的RSD為1.5%，表明馬尿酸在24?h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.5?精密度試驗?按“1.2.4.5”方法操作，峰面積分別為2?251?855、2?278?469、2?261?029、2?241?584、2?271?489、2?230?369，計算得出平均峰面積為2?255?799，峰面積的RSD為0.81%，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.6?加樣回收試驗?由表2可見，馬尿酸的平均回收率為98.9%，RSD為0.73%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于供試品中馬尿酸的含量測定。

3?結(jié)論與討論

該試驗建立了一種評價翡翠貽貝酶解液體外活性評價的高效液相色譜方法，此方法在馬尿酸為0.02～0.20?mg/mL具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.9%，在24?h內(nèi)穩(wěn)定性良好。可見HPLC法方便、準(zhǔn)確、快速，可以作為篩選高降壓活性的翡翠貽貝酶解液的快速分析方法。此外，在試驗過程中，筆者發(fā)現(xiàn)已溶解的ACE酶在-20?℃的條件下極易失活，且價格昂貴，建議實驗室自制。筆者研究了加入1?moL/L?HCl鹽酸終止反應(yīng)后，加入1.2?mL乙酸乙酯提取后過濾進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)回收率僅為50%，故乙酸乙酯提取并不適用于翡翠貽貝酶解液的降壓活性評價。

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