綠茶蛋白質的提取及抗氧化肽的制備研究

張子迪 李宜慧 朱彩霞 楊薇 白東清 李濤

摘要?[目的]對茶葉蛋白質的最佳提取條件進行研究，并研究茶葉蛋白酶解產物的抗氧化性，為茶葉的高附加值利用提供思路。[方法]采用超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質，采用響應面法進行茶葉蛋白提取工藝的優(yōu)化。將茶葉蛋白采用風味蛋白酶進行水解，獲得具有抗氧化活性的茶葉多肽。[結果]?通過響應面法得到茶葉蛋白的最佳理論提取條件：提取時間120?min，提取溫度59.02??℃，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20。在此條件下，預測得到的茶葉蛋白質最大提取量為29.79%，經過驗證后，茶葉蛋白的最大提取量達到28.39%。利用風味蛋白酶酶解茶葉蛋白獲得具有較強抗氧化能力的多肽混合物，酶解的最佳條件為：酶解時間?60?min，?酶解溫度60??℃，酶解pH?7.0，?酶用量?9%。[結論]該研究開發(fā)了一種茶葉蛋白的提取工藝，并且茶葉蛋白可以通過風味蛋白酶酶解制備綠色、天然的抗氧化劑。

關鍵詞?茶;蛋白提取;抗氧化性;響應面優(yōu)化

中圖分類號?TS272.5+1文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0202-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.058

Study?on?the?Extraction?of?Protein?from?Green?Tea?and?Preparation?of?Antioxidant?Peptides

ZHANG?Zidi，LI?Yihui，ZHU?Caixia?et?al

（College?of?Basic?Science，?Tianjin?Agricultural?University，?Tianjin?300384）

Abstract?[Objective]?To?study?the?optimum?extraction?conditions?of?protein?from?tea?and?investigate?the?antioxidant?property?of?the?enzymatic?hydrolysates?of?tea?protein，?so?as?to?provide?a?new?perspective?for?the?high?addedvalue?development?of?tea?protein.?[Method]?The?ultrasoundassisted?alkali?method?was?used?for?the?extraction?of?tea?protein，?and?the?extraction?process?was?also?optimized?through?the?response?surface?methodology.?The?antioxidant?tea?peptides?were?obtained?by?hydrolyzing?the?purified?tea?protein?with?flavor?protease.?[Result]The?predicated?optimum?conditions?for?the?extraction?of?tea?protein?were?as?follows：?extraction?time?of?120?min，?extraction?temperature?of?59.02??℃，?alkali?concentration?of?0.65?mol/L，?and?material/solvent?ratio?of?1∶20.?The?predicted?maximum?protein?extracted?yield?was?29.79%?under?these?conditions.?The?actual?yield?of?extracted?tea?protein?was?28.39%?after?verification?by?experiment.?The?peptides?which?were?obtained?by?hydrolyzing?the?tea?protein?using?flavourzyme?demonstrated?good?antioxidant?property.?The?optimum?enzymatic?hydrolysis?conditions?getting?from?single?factor?experiment?were：?the?reaction?time?of?60?min，?the?reaction?temperature?of?60?℃，?the?pH?value?of?7，?and?the?dosage?of?flavourzyme?of?9%.?[Conclusion]We?successfully?developed?a?new?extraction?method?for?the?tea?protein，?and?studied?the?antioxidant?property?of?the?enzymatic?hydrolysates?of?tea?protein.?The?results?showed?that?it?could?be?developed?to?a?kind?of?green?natural?antioxidant.

Key?words?Tea;Protein?extraction;Antioxidant;Response?surface?methodology

基金項目?天津市高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（200810061098）。

作者簡介?張子迪?（1998—），女，天津人，專業(yè)：生物制藥。通信作者，講師，博士，從事天然活性多肽方面的研究。

收稿日期?2019-12-29

茶為山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木植物，主要分布于中國、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡、肯尼亞等熱帶和亞熱帶地區(qū)。茶最早被人們認知是因其藥用價值?！渡褶r本草經》中有記載“神農嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之”;同樣唐代陳藏器編寫的《本草拾遺》中也有“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”的記載。

茶葉中成分復雜，其中有機化合物的比例最高，約450種，占茶葉鮮重的15%～21%。茶葉中的主要有機物為茶多酚（20%～35%）、蛋白質（20%～30%）、多糖（20%～25%）、脂肪（約8%）、生物堿（2%～5%），有機酸（約3%）、維生素（0.6%～1.0%）等[1]。目前茶多酚的成分及功效研究的比較深入，主要是一系列含有2-苯基苯并吡喃結構的類黃酮類物質，是茶葉中的主要功能保健成分。研究表明茶多酚具有清除人體內自由基[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、調血脂[6]、防治動脈粥樣硬化[7]方面都有明顯效果。

茶葉中的蛋白質含量僅次于茶多酚的量，其蛋白質組成為82.05%的谷蛋白和13.61%的醇溶蛋白[8-9]。除了具有營養(yǎng)品質，這些茶葉蛋白質還可以較強的清除氧自由基。大部分的茶葉蛋白易溶于堿不溶于水，是大部分茶葉蛋白質所具備的特征[8-9]。堿液對蛋白質的氫鍵很有破壞作用，并且蛋白質的極性基團，在堿液中會發(fā)生解離，那么蛋白質的表面就會具有相同的電荷，這樣蛋白質分子的溶解就會增多，提取率也就提高了[10-11]。

蛋白質在酶的作用下，能夠水解生成有抗氧化性的酶解產物，會產生多肽片段，這些多肽片段具有強抗氧化作用[12]，這是蛋白酶解產物具有較強抗氧化作用的主要原因。酶解蛋白制備抗氧化肽也是目前獲得此類抗氧化多肽的重要方法。筆者從茶葉綜合利用的角度出發(fā)，對茶葉中的蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，并進行了茶葉蛋白酶法制備抗氧化肽的研究，以期為茶葉廢棄物的資源化利用提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?茶葉蛋白提取的單因素試驗?將市售的綠茶葉放入小型高速粉碎機中粉碎，過70目篩，制成茶葉粉，待用。

1.1.1?提取時間對茶葉蛋白質提取率的影響。

稱取茶葉粉1?g放入50?mL的離心管中，按照料液比為1∶40（m/V，g∶mL）加入0.5?mol/L?NaOH?溶液，并在2?000?r/min轉速下攪拌均勻分散，50??℃下超聲波輔助提取60、75、95和120?min。茶葉提取混合液離心10?min（10?000?r/min，4??℃）。將上清液稀釋到合適的倍數(shù)后，檢測蛋白質的含量，計算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.2?提取溫度對茶葉中蛋白質提取率的影響。

稱取1?g茶葉粉，按照料液比為1∶40（m/V）加入0.5?mol/L?NaOH?溶液，混合均勻，分別在50、60、70和80??℃條件下進行超聲波輔助提取茶葉蛋白質，采用考馬斯亮藍G250法測定蛋白質的含量，計算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.3?堿液濃度對茶葉蛋白質提取的影響。

稱取1?g茶葉粉，按照料液比為1∶40（m/V）分別加入0.15、0.30、0.50和0.70?mol/L?NaOH?溶液，在50??℃下超聲波輔助提取60?min，測量提取液中蛋白質的含量，并計算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.4?料液比對茶葉蛋白質提取的影響。

稱取1?g茶葉粉，提取溫度為50??℃，提取時間為60?min，堿液濃度為0.5?mol/L，分別在料液比（m/V）為1∶20、1∶30、1∶40和1∶50條件下進行超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質，測量提取液中蛋白質的含量，計算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.2?響應面法優(yōu)化茶葉蛋白的提取工藝

根據(jù)超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質的單因素試驗結果，選擇提取時間、提取溫度、堿液濃度和料液比4個因素為響應面設計中的關鍵因素，以茶葉蛋白質提取率為響應值，進行Box-Behnken的中心組合試驗方案的設計。應用Design-Expert8.05b軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立茶葉蛋白質提取率與設計因素的回歸模型，對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質的提取率進行預測分析;對模型進行回歸方差分析顯著性檢驗，確定各因素對茶葉蛋白質提取率的影響規(guī)律，分析各因素間交互作用，繪制影響因素的響應面圖，根據(jù)回歸模型確定茶葉蛋白的最佳提取工藝，并進行驗證。

1.3?茶葉蛋白質的分離與純化

根據(jù)響應面分析法優(yōu)化所得到的最佳提取條件，進行茶葉蛋白質的提取。蛋白提取液冷卻至室溫后，用HCl調節(jié)pH至7.0，在10000?r/min條件下，離心10?min，收集上清液，并按提取液：無水乙醇（1∶5，V/V），的比例加入冰乙醇，放入4??℃的冰箱靜置1?h。然后將沉淀混合液在10?000?r/min條件下，離心10?min，離心完成后，棄去上清液，收集沉淀蛋白，并用0.1?mol/L、pH?7.4?的PBS溶液將沉淀蛋白進行溶解，得到茶葉蛋白質的粗提液。將茶葉粗蛋白采用葡聚糖凝膠Sephadex?G-25層析柱分離純化，流速為0.3?mL/min，洗脫液每管收集3?mL，并測量在280?nm處的吸光度值，繪制出洗脫曲線。將收集到的茶葉蛋白溶液進行冷凍干燥，得到茶葉蛋白粉。

1.4?茶葉蛋白的酶解及酶解產物抗氧化活性的檢測

1.4.1?酶解時間對茶葉蛋白酶解產物抗氧化活性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0的PBS?緩沖液溶解，按底物蛋白的10%的比例加入風味蛋白酶，酶解溫度為60??℃，酶解時間分別為30、45、60和75?min。反應結束后，采用連苯三酚自氧化法測定茶葉多肽的抗氧化活性，確定酶解時間對茶葉蛋白酶解產物抗氧化性的影響。

1.4.2?酶解溫度對茶葉蛋白酶解產物抗氧化活性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0?的PBS緩沖液溶解，按照底物蛋白的10%的比例加入風味蛋白酶，反應時間為60?min，在40、50、60和70??℃條件下進行酶解反應，檢測酶解產物的抗氧化活性，確定反應溫度對酶解產物抗氧化性的影響。

1.4.3?pH對茶葉蛋白酶解產物抗氧化性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用不同pH的緩沖液進行溶解（pH?5.7、6.5、7.0、7.5），按照底物蛋白的10%的比例加入風味蛋白酶，反應時間為60?min，檢測酶解產物的抗氧化活性，?分析pH對酶解產物抗氧化性的影響。

1.4.4?酶用量對茶葉蛋白酶解產物抗氧化性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0?的PBS緩沖液溶解，反應時間為60?min，反應溫度為60??℃，酶用量分別為底物蛋白的2%、4%、6%、8%和10%。酶解反應結束后，進行產物抗氧化性的測定，分析酶用量對茶葉蛋白酶解產物抗氧化性的影響。

1.5?蛋白濃度的測定

根據(jù)BCA?蛋白濃度測定試劑盒（增強型）要求，將試劑A與試劑B以50∶1的比例配制成工作液。配制0.5?g/mL?標準蛋白溶液。將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20?μL加入96?孔平板中，加入蒸餾水稀釋至20?μL。各孔加入200?μL的BCA?工作液，37??℃放置30?min。用酶標儀在562?nm波長下測定吸光度，然后以標準蛋白濃度、吸光度分別對應于橫、縱坐標來繪制標準曲線。取20?μL樣品溶液加入BCA工作液200?μL，37??℃保溫30?min。在562?nm波長下測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算出樣品濃度。

1.6?抗氧化活性的測定[13]

取3?mL的0.1?mol/L?Tris-HCl緩沖液（pH?8.0），在325?nm處進行空白調零后，取2.95?mL的Tris-HCl溶液，加入50?μL?60?mmol/L的連苯三酚溶液，迅速顛覆式混合，倒入石英比色皿中，在325?nm處記錄反應進行30和300?s時的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s，?記為△A0;取2.90?mL的Tris-HCl溶液，加入50?μL的上清液，再加入50?μL?60?mmol/L的連苯三酚溶液，迅速顛覆式混合，分別在30和300?s時測量在325?nm處的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s?記作△A樣，則樣品對自由基的清除率按以下公式計算：清除率=（△A0-△A樣）/△A0×100%。

2?結果與分析

2.1?超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質

2.1.1?提取時間對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質提取率的影響。由圖1可知，當提取時間為60～95?min時，隨著時間的增長，蛋白質提取率提高，而提取時間繼續(xù)延長（120?min），茶葉蛋白的提取量有小幅下降。提取時間為95?min時，蛋白質提取率達到最大值15.03%，表明在提取時間為95?min時，大部分茶葉蛋白質都已經完全溶解于提取液中。

2.1.2?提取溫度對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質提取率的影響。由圖2可知，

隨溫度的升高，蛋白質提取率提高，在60??℃時蛋白的提取量達到最大值（18.2%），隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質提取率有所下降。由于蛋白質在高溫的條件下容易變性，甚至降解[14]。為了降低高溫對茶葉蛋白質的不利影響，并且節(jié)約能耗，選擇60?℃為最佳提取溫度。

2.1.3?堿液濃度對超聲波輔助堿法提取茶葉中蛋白質提取率的影響。由圖3可知，

隨著堿液濃度的增大，蛋白質提取率提高，堿液濃度為0.5?mol/L?時，茶葉蛋白的提取量達到最大，隨著堿液濃度的增大，蛋白質提取量有所下降。在堿液濃度為0.5?mol/L時，蛋白質提取率達到最大為16.27%，說明大部分茶葉蛋白質在濃度為0.5?mol/L的堿液中被溶出。

2.1.4?料液比對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質提取率的影響。由圖4可知，

當料液比為1∶20～1∶40時，隨料液比的增大，蛋白質提取率逐漸提高，而隨著料液比的繼續(xù)增大，蛋白質提取率有少量下降。由于料液比太大，在提取后會造成廢水處理的負擔，并會使提取液中的蛋白質濃度偏低，這樣會造成蛋白質難以絮凝沉淀，所以在單因素條件下料液比以1∶30最佳。

2.2?響應面分析法優(yōu)化茶葉蛋白提取工藝條件

2.2.1?響應面試驗設計。

根據(jù)BoxBehnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗的結果，選取提取時間?（A）、提取溫度（B）、堿液濃度（C）和料液比（D）4個因素，采用4因素3水平的響應面分析方法進行優(yōu)化分析，試驗因素和水平見表1。

2.2.2?響應面分析法優(yōu)化試驗結果。

選擇Box-Behnken中心組合試驗模型，進行4因素3水平的響應面分析試驗，共有29個試驗點。試驗點可以分為2類，一類是析因點，共有24個，是自變量的取值在4個因素所構成的三維頂點;另一類是區(qū)域的中心點，中心點試驗需要重復5次，是為了估算試驗誤差。最后的影響值是茶葉蛋白質提取量。BoxBehnken試驗設計及結果見表2。

利用Design-Expert?8.05b軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到蛋白質提取率對以上4個因素的二次多項式回歸模型：?茶葉蛋白提取量=22.89-0.50A-2.17B+3.62C+3.06D+1.69AB+1.75AD+0.65BC-0.85BD+3.59CD+2.18A2-4.10B2-4.30C2-2.64D2。

對該回歸模型進行方差分析，結果如表3所示。該回歸方程在描述4個因素和響應值的關系時，二次多項回歸模型顯著，但各因素對蛋白質提取率的影響不是簡單的線性關系。二次多項回歸模型的一次項C（堿液濃度）、D（料液比）極其顯著，B（提取溫度）顯著;二次項B2（提取溫度）、C2（堿液濃度）極其顯著;交互項CD顯著。根據(jù)二次多項式回歸方程各項的方差分析結果，可以看出方程的失擬項較小，表明該方程對試驗擬合情況好、誤差小，得到的二次多項回歸模型可以較好的分析和預測茶葉蛋白質的提取率。

提取時間與提取溫度、提取時間與堿液濃度、提取時間與料液比之間的交互作用不顯著;堿液濃度和料液比之間交互作用較顯著，其響應面交互作用情況如圖5所示。

根據(jù)響應面優(yōu)化得到的模型方程，預測提取的茶葉蛋白的最高量可以達到29.80%，達到該最高值的條件：提取時間120?min，提取溫度59.02??℃，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20。為了檢驗響應面分析法得出的茶葉蛋白質提取率模型的合適性和有效性，需要在最佳條件下進行三組驗證試驗，考慮到實際情況，提取溫度定為60??℃，提取時間為120?min，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20，得到蛋白質提取率的試驗平均值為28.39%，與模型預測值29.80%的差值僅占預測值的4.73%，這充分說明了該模型可以較好的分析和預測超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質的提取率。

2.3?茶葉蛋白質的分離與純化

將提取所得蛋白溶于PBS溶液中，用葡萄糖凝膠Sephadex?G-25層析柱，進行凝膠過濾層析法分離純化。根據(jù)圖6的蛋白質的洗脫峰進行收集洗脫液，收集第10管到38管間的洗脫液，合并并進行冷凍干燥，從而得到純化了的綠茶蛋白質粉末。

2.4?茶葉蛋白酶解產物抗氧化活性分析

2.4.1?反應時間對酶解產物抗氧化性的影響。由圖7可知，

當反應時間?30～60?min時，隨著酶解反應時間的增長，茶葉蛋白酶解產物自由基清除率不斷上升;當反應時間為60～75?min時，隨著反應時間的增長，自由基清除率稍有下降。因此選定60?min為最適酶解反應時間，自由基的清除率為?48.2%。

2.4.2?反應溫度對酶解產物抗氧化性的影響。由圖8可知，

當酶解反應溫度為40～60?℃時，隨著反應溫度的升高，自由基清除率不斷上升，而反應溫度在60～70?℃時，隨著反應溫度的升高，超自由基清除率下降明顯，說明溫度升高，對風味蛋白酶活性的影響很大。這是因為在風味蛋白酶酶解蛋白質的過程中，反應效率受溫度的影響主要表現(xiàn)在以下2個方面：一方面是對風味蛋白酶催化反應速率的影響，另一方面則是對風味蛋白酶穩(wěn)定性的影響。在一定的范圍內升高溫度，會使蛋白質酶解的速度加快，即酶解效率被提高。但是當溫度超過一定的限度，過高溫度會造成酶分子的變性，那么風味蛋白酶的穩(wěn)定性會降低，這樣酶解的效率就會下降[15]。因此，選定60?℃為酶解反應溫度。

2.4.3?pH對酶解產物抗氧化性的影響。由圖9可知，當酶解反應體系的pH?為7.0時，茶葉蛋白酶解產物對自由基清除能力達到最高值（52.1%）。當pH為7.5時，酶解產物的抗氧化能力最低，可能在弱堿性環(huán)境中，就會造成風味蛋白酶分子的構象的改變，造成酶解效率的降低。因此，選定pH?7.0為茶葉蛋白酶解制備抗氧化肽的反應pH。

2.4.4?酶量對酶解產物抗氧化性的影響。由圖10可知，當酶量為3%～9%時，隨著酶量的增大，茶葉蛋白酶解產物的自由基清除率不斷上升;當酶量為9%～12%時，酶量的增加對超氧自由基清除率的影響基本保持不變?；诔杀痉矫娴目紤]，增加酶量，就意味著成本的增加。因此希望用酶量盡量少，同時保證得到的酶解產物較高的抗氧化能力，并發(fā)揮酶的最大催化作用，避免造成浪費?[16]。由于酶量是底物蛋白質的9%～12%時，呈現(xiàn)趨勢基本穩(wěn)定，考慮到成本問題，因此選定9%為最佳反應酶量。

3?結論

通過對茶葉蛋白質提取條件的研究，進行了單因素試驗，并采用響應面法優(yōu)化了茶葉蛋白質的提取條件。?根據(jù)模型預測當提取時間為120?min，提取溫度是59.02??℃，堿液濃度為0.65?mol/L，料液比為1∶20時，預測得到的茶葉蛋白最大提取產量為29.79%，而驗證結果表明在此條件下蛋白質提取率的試驗平均值為28.39%，與模型預測值29.80%的差值僅占預測值的4.73%，充分說明了該模型可以較好的分析和預測超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質的提取率。?造成偏差原因可能是實際提取試驗中，超聲波提取裝置會在超聲過程中升溫，造成溫度的變化，溫度對實驗結果的影響又很大，所以才會略有出入。提取的茶葉蛋白質經過風味蛋白酶酶解后，酶解產物具有較高的超氧自由基清除率，該試驗結果表示茶葉蛋白質的酶解產物有很好的抗氧化性，可以被應用于食品產業(yè)，來開發(fā)一種新型、綠色、天然的抗氧化劑。

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