106份水稻材料稻瘟病抗性鑒定及Pi9基因的分子檢測

陳晴晴 夏加發(fā) 張海珊 張愛芳

摘要?采用苗期噴霧接種鑒定方法并利用Pi9基因的特異性分子標(biāo)記檢測，分析106份水稻材料的稻瘟病抗性水平及Pi9基因的分布情況。結(jié)果表明，106份水稻材料對供試菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分別為94.3%、92.4%、92.4%、87.7%、59.4%、62.3%;27份水稻材料（占25.5%）含有Pi9基因，其對供試菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分別為100%、100%、100%、96.3%、88.9%、92.6%?？梢?，Pi9基因在安徽省水稻抗病育種中具有一定應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞?稻瘟病;Pi9基因;抗性鑒定;分子檢測

中圖分類號?S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.043

Evaluation?and?Distribution?of?the?Blast?Resistance?Gene?Pi9?of?106?Rice?Materials

CHEN?Qingqing1，?XIA?Jiafa2，?ZHANG?Haishan1?et?al

（1.Institute?of?Plant?Protection?and?Agricultural?Product?Quality?and?Safety，?Anhui?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Hefei，Anhui??230031;2.Rice?Research?Institute，?Anhui?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Hefei，Anhui??230031）

Abstract?106?rice?materials?were?assessed?for?blast?resistance?and?resistance?gene?Pi9?distribution?by?using?specific?molecular?markers.?The?results?showed?that?the?resistance?rates?of?106?rice?materials?to?the?tested?strains?ZB1，?ZB2，?ZB3，?ZA0，?ZA1?and?ZA2?were?94.3%，?92.4%，?92.4%，?87.7%，?59.4%?and?62.3%.?27?materials?（25.5%）?contained?the?resistance?gene?Pi9?and?the?resistance?rate?to?the?tested?strains?ZB1，?ZB2，?ZB3，?ZA0，?ZA1?and?ZA2?were?100%，?100%，?100%，?96.3%，?88.9%?and?92.6%.?It?can?be?seen?that?the?resistance?gene?Pi9?has?certain?application?value?in?rice?breeding?for?disease?resistance?in?Anhui?Province.

Key?words?Rice?blast;Pi9?gene;Resistance?identification;Molecular?detection

基金項(xiàng)目?安徽省科技重大專項(xiàng)（18030701175）。

作者簡介?陳晴晴（1987—），女，安徽蚌埠人，研究實(shí)習(xí)員，從事水稻病害抗性鑒定與評價研究。通信作者，副研究員，從事水稻病害抗性鑒定與評價研究。

收稿日期?2019-12-10;修回日期?2020-01-10

稻瘟病是由稻梨孢屬真菌[Magnaporthe?grisea（Hebert）Barr，無性態(tài)為Pyricularia?grisea（Cooke）Sacc.]引起的水稻三大病害之一，在全球水稻種植區(qū)均有發(fā)生，導(dǎo)致每年水稻產(chǎn)量損失10%～15%，損失達(dá)數(shù)十億美元，嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)[1-3]。稻瘟病也是我國南北稻區(qū)危害最嚴(yán)重的病害之一，每年都有幾個稻作區(qū)中等或偏重流行，且有增長趨勢，因此如何防治和減少病害發(fā)生，對水稻生產(chǎn)具有重要意義[4-5]。

實(shí)踐證明，選育和種植抗病水稻品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，而發(fā)掘和利用水稻抗性遺傳資源是水稻抗稻瘟病育種的基礎(chǔ)[6]。近年來發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確鑒定出材料中所含的抗性基因類型，并利用與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，這對于培育抗稻瘟病水稻品種有重要意義[7]。

Pi9基因源自小粒野生稻，位于水稻6號染色體，是NBS-LRR類基因，是已克隆的抗稻瘟病主效基因之一，抗性比較廣，對來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性[8-10]。鄒德堂等[11]研究表明Pi9基因在黑龍江省水稻抗病育種中具有很高應(yīng)用價值，在黑龍江省乃至全國范圍內(nèi)加強(qiáng)對Pi9基因推廣和應(yīng)用意義重大。

筆者采用苗期噴霧接種鑒定方法對106份水稻材料進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，并利用特異性分子標(biāo)記檢測方法對其Pi9基因的分布情況進(jìn)行分析，以期明確Pi9基因在提高水稻抗病性方面的價值，為安徽省抗稻瘟病品種選育提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?水稻材料。106份供試水稻材料由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。單18（含Pi9基因）系作為陽性對照;麗江新團(tuán)黑谷作為陰性對照。

1.1.2?供試菌株。供試菌株是筆者所在課題組在安徽省內(nèi)采集并分離鑒定的6個菌株（ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?稻瘟病抗性鑒定。將供試菌株轉(zhuǎn)接于PSA（馬鈴薯蔗糖瓊脂粉）培養(yǎng)基上，在25～27?℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7?d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，將長滿菌絲的培養(yǎng)基切塊移植到大麥粒培養(yǎng)基中，待稻瘟病菌產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水清洗、過濾至燒杯中，配制孢子懸浮液（10×10倍光學(xué)顯微鏡每視野15～20個孢子）[12]。

供試材料經(jīng)過浸種、催芽后，播種在育秧盤中，每份材料10～15粒。待秧苗3～4葉期時，用供試菌株孢子液噴霧接種。接種后置于25～28?℃溫室內(nèi)，并定時噴霧保濕。接種7?d后，參照國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況：0級為高抗（HR），1～2級為抗（R），3級為中抗（MR），4～5級為中感（MS），6～7級為感（S），8～9級為高感（HS）[13-14]。

1.2.2?水稻DNA提取及PCR檢測。使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-02）提取水稻葉片基因組DNA，并保存于-20?℃?zhèn)溆?。選用與Pi9基因緊密連鎖的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列由筆者所在課題組前人提供，Pi9-1F/R（5′—3′）：TGCCCAACCTTTACCCACTGTA/?AACATGAGTAGAAACAAATTAGTTTG，并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積20?μL，包括10?μL?2×SanTaq?PCR?Mix（含藍(lán)染料），2?μL模板DNA，正、反向引物各1?μL，6?μL?ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性45?s，55?℃退火45?s，72?℃延伸1?min，34個循環(huán);72?℃延伸10?min，4?℃保存。8?μL擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照[15-16]。

1.3?數(shù)據(jù)分析

根據(jù)水稻材料抗性水平調(diào)查結(jié)果計(jì)算其抗病率，抗病率=（高抗+抗+中抗）/總數(shù)×100%[17]。依據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，判斷供試水稻材料中Pi9基因的有無。

2?結(jié)果與分析

2.1?水稻材料對稻瘟病的抗性表現(xiàn)

利用采自安徽的6個稻瘟病菌株分別接種供試水稻材料，結(jié)果見表1。由表1可知，106份水稻材料分別接種供試菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2后，判斷抗病材料分別有100份（94.3%）、98份（92.4%）、98份（92.4%）、93份（87.7%）、63份（59.4%）、66份（62.3%）?？芍?，供試水稻材料對安徽省稻瘟病菌ZB群的抗性表現(xiàn)較好。

根據(jù)抗性水平調(diào)查結(jié)果，106份水稻材料對所有供試菌株均表現(xiàn)抗病（0～3級）的材料有53份，占比50%。由此篩選出抗病材料，為安徽省水稻抗病育種提供材料。

2.2?Pi9基因的分子檢測結(jié)果

利用Pi9基因的特異性分子標(biāo)記對供試水稻材料進(jìn)行檢測，27份供試材料與單18（陽性對照）一樣能在750～1?000?bp處擴(kuò)增出1條特異條帶，表明它們均含有Pi9基因;其余供試材料與麗江新團(tuán)黑谷（陰性對照）一樣，沒有擴(kuò)增出條帶，表明不含Pi9基因（圖1）。含有Pi9基因的材料占供試水稻材料的25.5%，說明Pi9基因在供試水稻材料中占比不高。

2.3?含Pi9基因的水稻材料對稻瘟病的抗性表現(xiàn)

由表2可知，27份含有Pi9基因的水稻材料對供試菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3的抗性水平全部達(dá)到中抗及以上（抗病率為100%），對ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分別為96.3%、88.9%、92.6%。可知，含有Pi9基因的水稻材料抗病率明顯較高。

3?結(jié)論與討論

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最主要，也是最嚴(yán)重的病害之一，發(fā)病嚴(yán)重且易反復(fù)[18]。安徽省水稻生態(tài)環(huán)境多樣，氣候條件復(fù)雜，特別是江淮丘陵和皖西南山區(qū)，稻瘟病常年有不同程度發(fā)生，有的年份暴發(fā)成災(zāi)，損失嚴(yán)重。區(qū)試參試品種對稻瘟病的抗性表現(xiàn)整體不高[12]。另外，由于稻瘟病菌生理小種存在遺傳復(fù)雜性、致病性多樣性，生產(chǎn)中推廣的種植品種3～5年就會喪失抗性。因此，挖掘抗性水平高的種質(zhì)資源，對于提高稻瘟病抗性具有重要意義[19]。近年來，育種和植保工作者協(xié)同攻關(guān)，不斷發(fā)掘稻瘟病抗源。閻勇等[20]從52份華南常用秈稻親本中篩選獲得廣譜抗性材料4份，其中2份抗譜為100%，可利用這些抗源拓寬育種材料的遺傳背景。該研究從106份水稻材料中獲得53份抗病材料，其對所有供試菌株均表現(xiàn)中抗及以上，表明安徽省育種工作者可以對其利用研究。

目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)對水稻材料進(jìn)行抗性基因檢測，可以提高抗病基因鑒定及育種選擇的效率[21-22]。Pi9基因是已報(bào)道的稻瘟病抗性主效基因之一，研究表明，Pi9基因?qū)ξ覈饕緟^(qū)稻瘟病病菌具有較好的抗性，在抗病育種中有很大利用價值[23-26]。該研究分析Pi9基因在水稻材料中的分布情況，篩選出27份含有Pi9基因的水稻材料，為今后育種工作中優(yōu)良品種選育提供理論依據(jù)。結(jié)合抗病性鑒定結(jié)果，Pi9基因在安徽省抗病育種中具有較高的應(yīng)用價值。

另外，考慮多個抗病基因綜合應(yīng)用，利用多個優(yōu)良基因拓寬抗譜，是提高水稻品種抗性、減緩品種抗性喪失和培育具有持久抗性品種的途徑[27-29]。該研究所獲得的抗病材料中可能含有其他抗性基因，有待進(jìn)一步發(fā)掘和利用。

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