假單胞菌增殖培養(yǎng)基中碳源氮源的優(yōu)化

宮達(dá)非 廖靜云 曾慧帆 尚?；?/p>

摘要?[目的]提高假單胞菌的增殖，降低生產(chǎn)成本。[方法]采用光電比濁法，通過單因素試驗(yàn)對(duì)假單胞菌增殖培養(yǎng)基的碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]?假單胞菌增殖培養(yǎng)基中最佳的碳源、氮源種類與濃度分別為蔗糖0.5?g/L、魚蛋白胨1.2?g/L。[結(jié)論]通過對(duì)增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化，降低了生產(chǎn)成本。

關(guān)鍵詞?假單胞菌;碳源;氮源;優(yōu)化

中圖分類號(hào)?Q93-33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0083-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.025

Optimization?of?Carbon?and?Nitrogen?Sources?of?Enrichment?Medium?for?Pseudomonas

GONG?Dafei1，2，LIAO?Jingyun1，2，ZENG?Huifan1，2?et?al

（1.College?of?Life?Science，Guangxi?Normal?University，Guilin，Guangxi?541006;2.Key?Laboratory?of?Ecology?and?Environmental?Protection?of?Rare?and?Pndangered?Animals?and?Plants，Ministry?of?Education，Guilin，Guangxi?541006）

Abstract?[Objective]To?improve?the?proliferation?of?Pseudomonas?and?reduce?the?production?cost.[Method]?The?photoelectric?turbidimetry?method?was?used?to?optimize?the?carbon?and?nitrogen?sources?of?Pseudomonas?enrichment?medium?by?single?factor?test.[Result]The?optimal?carbon?source?and?nitrogen?source?species?and?concentration?in?Pseudomonas?enrichment?medium?were?sucrose?0.5?g/L?and?fish?protein?1.2?g/L，respectively.?[Conclusion]By?optimizing?the?enrichment?medium，the?production?cost?was?reduced.

Key?words?Pseudomonas;Carbon?source;Nitrogen?source;Optimization

基金項(xiàng)目?廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2018KY0086）;廣西師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2017BQ015）;廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（JGY2019009）。

作者簡介?宮達(dá)非（1996—），女，?吉林四平人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)與分子生物學(xué);廖靜云（1994—），女，廣西來賓人，本科，專業(yè)：生物科學(xué);曾慧帆（1997—），女，海南澄邁人，本科，專業(yè)：生物科學(xué)。宮達(dá)非、廖靜云、曾慧帆為共同第一作者。通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物學(xué)與分子生物學(xué)研究。

收稿日期?2019-08-15;修回日期?2019-09-20

假單胞菌屬（Pseudomonas）隸屬于薄壁菌門假單胞菌科，該屬由Migula在1894年創(chuàng)立，包括200余種細(xì)菌[1]。它們大多為革蘭氏陰性桿菌，形態(tài)上有直的和彎曲的，非常細(xì)小，有單鞭毛或多鞭毛，并以鞭毛運(yùn)動(dòng)，沒有芽孢[2]。只能在有氧環(huán)境中生存，多分布于土壤、水體及植物體內(nèi)，在pH?7.0～8.5的范圍內(nèi)生長。能在4～43?℃下生長，生長溫度范圍廣泛，但大部分菌的生長溫度是30?℃，分解有機(jī)物的能力很強(qiáng)，而且可將多種有機(jī)物作為能量來源[3-4]。

假單胞菌對(duì)紫外線、消毒劑等殺菌手段，都有較強(qiáng)的抵御能力。研究發(fā)現(xiàn)，在人體的皮膚、呼吸道和腸道等部位假單胞菌也普遍存在[5]。此外，假單胞菌在生物防治等方面起著非常重要的作用。它能產(chǎn)生植物生長所需要的調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗生素，降解有毒物質(zhì)，促進(jìn)植物進(jìn)行營養(yǎng)生長;它能通過殺掉害蟲而起到生物防治的作用;其模式種的耐藥機(jī)制研究對(duì)醫(yī)學(xué)發(fā)展有重要的指導(dǎo)意義[6]。

該研究選用的假單胞菌Cr13由該實(shí)驗(yàn)室對(duì)從河池市南丹縣大廠鎮(zhèn)礦區(qū)獲得的重金屬污染土壤進(jìn)行平板篩選后獲得，該菌株可以耐受高濃度的六價(jià)鉻。為了降低假單胞菌的培養(yǎng)成本，促進(jìn)該菌種的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，筆者通過單因素試驗(yàn)對(duì)菌株Cr13增殖培養(yǎng)基的碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化。

1?材料與方法

1.1?材料?假單胞菌Cr13由珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)假單胞菌所用的碳源（牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、半乳糖和甘露糖）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸、硝酸銨、硝酸鉀、脲）、NaCl及瓊脂等均從廣西卓一生物技術(shù)有限公司購買。

1.2?儀器?722型光柵分光光度計(jì)（上海市第三分析儀器廠）;LYZ-1102恒溫?fù)u床（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）;ZHJH-C1106B超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機(jī)株式會(huì)社）;PH-18-FA1104分析天平（北京精測電子科技有限公司）。

1.3?方法

1.3.1?培養(yǎng)基。?牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0?g、蛋白胨10.0?g、NaCl?5.0?g、蒸餾水1?000?mL，pH?7.4～7.6，115?℃滅菌30?min備用。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%瓊脂。

1.3.2?菌種活化。?取-70?℃保存的菌種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28?℃培養(yǎng)24?h，作為種子液備用。

1.3.3?假單胞菌增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化。?以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1%接種量，28?℃恒溫培養(yǎng)，測定吸光度值。通過單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳碳源、氮源的種類以及濃度。

（1）碳源優(yōu)化。以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同濃度（0.3%）的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、半乳糖和甘露糖替換牛肉膏，其他成分及含量保持不變，考察不同種類碳源對(duì)假單胞菌增殖的影響。再依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選最適宜的碳源種類，并對(duì)其進(jìn)行碳源濃度優(yōu)化試驗(yàn)。

（2）氮源優(yōu)化。?以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同濃度（1%）的6種有機(jī)氮源（胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸）和3種無機(jī)氮源（硝酸銨、硝酸鉀、脲）替換蛋白胨進(jìn)行試驗(yàn)，其他成分及含量保持不變，考察相同濃度、不同種類的蛋白胨對(duì)假單胞菌增殖的影響。然后再依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選最適宜的氮源種類，考察氮源的不同濃度對(duì)假單胞菌增殖的影響。

1.3.4?光電比濁法測定生物量。接種后的增殖培養(yǎng)基于28?℃恒溫培養(yǎng)。到穩(wěn)定期后菌液用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，以相應(yīng)的空白培養(yǎng)基（不接種菌）作為對(duì)照，利用分光光度計(jì)測定OD600值。以進(jìn)入穩(wěn)定期后的3個(gè)平行組求平均值，以此確定生物量。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同種類碳源對(duì)假單胞菌的影響

碳源是一類可以影響假單胞菌生長繁殖及胞外多糖和抗生素等代謝產(chǎn)物合成的營養(yǎng)物質(zhì)[7-8]，因此適宜的碳源種類有利于假單胞菌的生長繁殖。該研究表明，以蔗糖作為假單胞菌增殖培養(yǎng)基的碳源時(shí)，吸光度值最高，其次是牛肉膏和半乳糖（圖1）。說明蔗糖對(duì)假單胞菌的生長繁殖有良好的效果，而且蔗糖的價(jià)格也很低。綜合考慮，該研究將進(jìn)一步考察不同蔗糖濃度對(duì)假單胞菌增殖的影響。

2.2?不同種類氮源對(duì)假單胞菌的影響

圖2表明，除了L-色氨酸作為有機(jī)氮源時(shí)菌株生長較慢，其他有機(jī)氮源促進(jìn)菌株生長的效果都優(yōu)于無機(jī)氮源。其中，魚蛋白胨作為氮源時(shí)培養(yǎng)假單胞菌的效果最好，吸光度值最高。其次是酵母粉與酪蛋白胨，而且魚蛋白胨的價(jià)格也很低。綜合考慮，該研究將進(jìn)一步考察魚蛋白胨的不同濃度對(duì)假單胞菌增殖的影響。

2.3?不同濃度的碳源對(duì)假單胞菌的影響?采用單因素試驗(yàn)考察碳源蔗糖的最佳濃度。結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖濃度在0.5～3.5?g/L的范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，蔗糖濃度的增大對(duì)假單胞菌生長的影響并不顯著（圖3）。綜合考慮成本因素，選擇0.5?g/L為蔗糖最適濃度。

2.4?不同濃度的氮源對(duì)假單胞菌的影響?采用單因素試驗(yàn)考察氮源與蛋白胨的最佳濃度。結(jié)果表明，不同濃度魚蛋白胨對(duì)假單胞菌生長的影響比較顯著，但當(dāng)魚蛋白胨濃度達(dá)到1.2?g/L后，濃度繼續(xù)增大對(duì)假單胞菌生長的影響并不顯著（圖4）。綜合考慮成本因素，選擇1.2?g/L為魚蛋白胨最適濃度。

3?討論

該研究發(fā)現(xiàn)，用蔗糖作為碳源時(shí)，培養(yǎng)假單胞菌Cr13的效果最為明顯，其次是半乳糖和可溶性淀粉。但是葡萄糖對(duì)假單胞菌Cr13生長的效果就較差，這與孫承文等[9]、郭叢等[10]的研究中以葡萄糖作為碳源時(shí)對(duì)假單胞菌生長影響顯著的試驗(yàn)結(jié)果不同，該研究確定的最適碳源蔗糖與王宇等[11]、譙天敏等[12]等所得的最適碳源一致，表明不同的假單胞菌菌株其最適碳源種類差別較大。

該研究表明，假單胞菌Cr13對(duì)不同種類氮源具有偏好性，有機(jī)氮源明顯優(yōu)于無機(jī)氮源，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源除了可以提供氮源外，還含有豐富的氨基酸和維生素等物質(zhì)，為假單胞菌Cr13的繁殖提供了有利的條件[13]。

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