一株好氧反硝化苯酚降解菌的篩選和降解特性分析

張崢 何勍 覃華靜 黃雪容 鄧冬梅

摘要?以苯酚為唯一碳源，通過(guò)富集培養(yǎng)方法從焦化廢水生物處理系統(tǒng)的好氧池活性污泥中分離出1株既具有降解苯酚能力也具有反硝化功能的菌株C3。根據(jù)16SrDNA序列分析，C3菌株和Pseudomonas?sp.的16SrDNA序列相似性達(dá)99%。通過(guò)單因素和響應(yīng)面法確定C3菌株的最優(yōu)環(huán)境條件為pH?7.5、溫度30?℃、初始苯酚濃度1.0?g/L、硝酸鹽氮濃度1.0?g/L，在該條件下，C3菌株對(duì)苯酚的降解率為89.3%，對(duì)硝酸鹽的降解率為81.3%，降解產(chǎn)物為N2。

關(guān)鍵詞?Pseudomonas?sp.;苯酚;好氧反硝化;降解特性

中圖分類號(hào)?X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0074-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.023

Screening?and?Characterization?of?Phenol?Degrading?Bacteria?with?the?Function?of?Aerobic?Denitrification

ZHANG?Zheng1，2，HE?Qing1，2，QIN?Huajing1，2?et?al

（1.College?of?Biological?and?Chemical?Engineering，Guangxi?University?of?Science?and?Technology，?Liuzhou，Guangxi?545006;2.Guangxi?Key?Laboratory?of?Green?Processing?of?Sugar?Resources，Liuzhou，Guangxi?545006）

Abstract?Using?phenol?as?the?sole?carbon?source，a?strain?C3?with?the?ability?of?degrading?phenol?and?denitrifying?was?isolated?from?the?activated?sludge?of?the?aerobic?tank?of?the?coking?wastewater?biological?treatment?system?by?enrichment?culture.According?to?16SrNDA?sequence?analysis，the?16SrDNA?sequence?similarity?between?C3?strain?and?Pseudomonas?sp.reached?99%.The?optimal?environmental?conditions?of?the?C3?strain?were?determined?by?single?factor?and?response?surface?methodology：?pH?7.5，temperature?30??℃，initial?phenol?concentration?1.0??g/L，nitrate?nitrogen?concentration?1.0?g/L.Under?these?conditions，the?degradation?rate?of?C3?strain?to?phenol?was?89.3%，the?degradation?rate?to?nitrate?was?81.3%，and?the?degradation?product?was?N2.

Key?words?Pseudomonas?sp.;Phenol;Aerobic?denitrification;Degradation?characteristics

基金項(xiàng)目

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017GXNSFBA198099）;廣西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（YB2014201，2016TZYKF10）;廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（YB2014201）;廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃資助（桂教人〔2014〕7?號(hào)）;2017年廣西國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201710594042）。

作者簡(jiǎn)介?張崢（1994—），男，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物。通信作者，副教授，博士，從事環(huán)境微生物方面研究。

收稿日期?2019-07-03;修回日期?2019-07-09

苯酚是環(huán)境中主要的水污染物之一，主要來(lái)源于煤氣、印染、石油化工等制造業(yè)廢水[1-2]，生物處理是目前廢水中苯酚降解的主要途徑[3]。研究表明，苯酚能被多種微生物降解，苯酚降解菌主要包括假單胞菌（Pseudonomonas.?sp）?[4]、酵母菌（Yeast?trichosporon）?[5]、芽孢桿菌（Bacillus.sp）?[6]、根瘤菌（Rhizobia）?[7]、白念珠菌（Candida?albicans）[8]等。為提高廢水中苯酚的降解率，亟需篩選更多高效的苯酚降解菌。

好氧反硝化菌是一種新型反硝化菌，主要存在于芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，多數(shù)為好氧或兼性好氧，并以有機(jī)碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌[9]。

研究表明，有些苯酚降解菌也具有反硝化功能，好氧反硝化苯酚降解菌的篩選可以為環(huán)境中苯酚和氮污染的治理提供有效菌源，也可為更深入探討苯酚降解機(jī)理提供研究材料。但目前篩選出的具反硝化功能的苯酚降解菌不多。為此，該研究從焦化廢水活性污泥中分離篩選得到1株好氧反硝化苯酚降解細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步研究該菌株的苯酚和硝酸鹽降解及菌株生長(zhǎng)情況，并考察環(huán)境因素對(duì)其苯酚降解能力的影響，為具有反硝化功能苯酚降解菌的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株。篩選自柳鋼焦化廢水生物處理系統(tǒng)好氧池中的活性污泥。

1.1.2?培養(yǎng)基。

細(xì)菌富集培養(yǎng)使用LB?培養(yǎng)基，包含蛋白胨?10?g/L、酵母膏?5?g/L、NaCl?10?g/L、苯酚（根據(jù)需要加入），pH?7.2～7.4。細(xì)菌分離和降解試驗(yàn)中，培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（mineral?salt?medium，MSM[10]），包含4.26??g/L?Na2HPO4、0.20?g/L?MgSO4·7H2O、0.02??g/L?CaC12、0.05??mg/L?KI、2.00?mg/L?MnSO4·4H2O、0.20??mg/L?CuSO4·2H2O、2.00??mg/L?ZnSO4·7H2O、2.50??mg/L?Na2MoO4·2H2O、82?μg/L?H3BO3、1.00?mg/L?FeC13·6H2O、苯酚，pH?7.2～7.6。固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中投加15??g/L?瓊脂。

1.2?方法

1.2.1?菌種的馴化和分離。

取10?mL新鮮活性污泥與90?mL無(wú)菌水混合振蕩，取5??mL上清液至含不同濃度苯酚的LB培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24?h，培養(yǎng)液依次轉(zhuǎn)移到含苯酚50、100、200、300、400、500?mg/L的MSM培養(yǎng)基中，30?℃，120?r/min條件下培養(yǎng)6?d。對(duì)生長(zhǎng)最好的一組培養(yǎng)液菌液，在MSM培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布及平板劃線分離，分離得到純菌株，進(jìn)一步對(duì)篩選的純菌株在含苯酚的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)其苯酚降解率，確定其苯酚降解特性。對(duì)復(fù)篩確認(rèn)有苯酚降解特性的純菌株，保存在15%的甘油中，-80?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?菌種鑒定。對(duì)分離得到的苯酚降解能力最強(qiáng)的苯酚反硝化菌株C3進(jìn)行革蘭氏染色和16SrDNA測(cè)序，以確定其種屬。16SrDNA測(cè)序時(shí)，首先利用細(xì)菌鑒定的通用引物27F?和1492R[11]對(duì)菌液進(jìn)行PCR?片段基因擴(kuò)增，引物由上海生工有限公司合成。反應(yīng)體系（50?μL）包括：?25??μL?DNA?聚合酶mix，菌液模板4?μL，去離子水17?μL，上下游引物各2?μL。PCR溫度程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性8?min，94?℃變性1?min，58?℃退火1??min，72??℃延伸1?min，循環(huán)29次，最后72?℃終延伸10??min，4?℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，純割膠化PCR產(chǎn)物。將回收的DNA送往上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測(cè)定;將序列在NCBI網(wǎng)頁(yè)上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)。

1.2.3?菌株降解條件及降解特性研究。以苯酚降解率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)研究pH、溫度和初始苯酚濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解苯酚的影響，根據(jù)環(huán)境單因素試驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert軟件生成3水平3因素組合條件（表1），根據(jù)所生成的各組合條件搖床培養(yǎng)菌株，測(cè)定培養(yǎng)2?d后苯酚濃度，計(jì)算降解率，所得結(jié)果輸入Design-Expert軟件，進(jìn)行分析。將C3菌在響應(yīng)面法所確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔5?h測(cè)定苯酚濃度、硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度以及菌液濃度，繪制生長(zhǎng)曲線和苯酚降解曲線。

苯酚降解率=苯酚降解前濃度-苯酚降解后濃度苯醛降解前濃度×100%

1.2.4?分析方法。

菌種濃度的測(cè)定采用比濁法，使用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600?nm?處測(cè)定其OD?值[12]。苯酚含量采用4-氨基安替比林分光光度法[11]測(cè)定;NO3--N含量利用二磺酸分光光度法測(cè)定;NO2--N含量利用N-?（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定[13]。

2?結(jié)果與分析

2.1?苯酚降解反硝化菌篩選鑒定

通過(guò)富集、初篩和復(fù)篩得到1株革蘭氏陽(yáng)性的反硝化苯酚降解菌株C3，菌落灰白色、蠟質(zhì)、圓形、邊緣整齊平滑。C3菌株在pH=7、30?℃、120?r/min、苯酚濃度為1?000?mg/L條件下對(duì)苯酚降解能力達(dá)86%。革蘭氏染色證明C3菌株為革蘭氏陽(yáng)性，對(duì)C3降解菌菌株的16SrDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，?發(fā)現(xiàn)其與Pseudomonas?sp.序列接近，同源性高達(dá)99%，因此初步鑒定該菌株為Pseudomonas?sp.（假單胞菌菌屬）。目前研究表明，苯酚降解菌大部分屬于假單細(xì)胞菌屬[14]，但有關(guān)其反硝化能力的研究報(bào)道很少。

2.2?環(huán)境因素對(duì)菌株苯酚降解和反硝化能力的影響

2.2.1?pH對(duì)苯酚降解率的影響。

如圖1所示，初始pH在6.5～8.0之間，C3菌體對(duì)苯酚均有一定降解率，pH=7.5左右時(shí)，C3對(duì)苯酚的降解率最高，達(dá)78%。圖2表明，隨著C3菌株對(duì)苯酚的降解，培養(yǎng)液中pH呈下降趨勢(shì)，降解10?h后，pH由7降至5，苯酚降解菌Comamonas?testosterone中也發(fā)現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)[15]。這可能是因?yàn)楸椒咏到饩谖⑸锝到獗椒訒r(shí)，需要將苯酚開(kāi)環(huán)為有機(jī)酸，才能進(jìn)一步為微生物利用，所以生長(zhǎng)降解過(guò)程中培養(yǎng)液pH逐步下降呈酸性。

2.2.2?苯酚初始濃度對(duì)苯酚降解率的影響。圖3表明，初始苯酚濃度為1?000?mg/L時(shí)，C3的苯酚降解率最大（99%）;苯酚濃度高于1?500?mg/L時(shí)，降解率呈緩慢下降趨勢(shì)，但下降幅度不大;苯酚濃度為2?200?mg/L時(shí)，降解率依然高于80%。高濃度苯酚對(duì)C3苯酚降解速率的影響可能與苯酚對(duì)微生物的毒性有關(guān)。

2.2.3?溫度對(duì)苯酚降解速率的影響。在20～30?℃之間，C3的苯酚降解速率隨溫度的增加而提高，溫度高于30?℃時(shí)，苯酚降解率隨溫度的增加而降低，在25～35?℃苯酚降解速率較快。

2.2.4?響應(yīng)面分析。

如表2所示，在設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件下，苯酚最大降解率達(dá)到89%，最小降解率為24%。

將表2?中的結(jié)果導(dǎo)入Design-Expert?軟件，固定一個(gè)環(huán)境因素的情況下，以另外2個(gè)環(huán)境因素為X?和Y?軸，以降解率為Z?軸作圖，得到不同降解條件下的苯酚降解率響應(yīng)曲面。如圖5所示，溫度和底物濃度、pH和底物濃度、溫度和pH對(duì)降解率的交互影響均不太顯著。由圖5還可知，C3菌株降解苯酚的最優(yōu)條件為：溫度30?℃、pH?7.5、底物濃度1?000?mg/L，在該條件下培養(yǎng)2?d后，對(duì)苯酚的降解效率達(dá)89%。

2.3?C3菌株生長(zhǎng)曲線及降解特性

圖6表明，培養(yǎng)28～32?h時(shí)，C3菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株生長(zhǎng)和苯酚降解及硝酸鹽氮的消耗是同步的，培養(yǎng)60?h后，苯酚濃度從1?000?mg/L降解到107?mg/L，苯酚降解率達(dá)89.31%，，硝酸鹽濃度從1?000?mg/L降解到187?mg/L，硝酸鹽降解率達(dá)81.30%。C3菌株生長(zhǎng)過(guò)程中伴有亞硝酸鹽積累，其中開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)，亞硝

酸鹽積累很少，但在接近對(duì)數(shù)期時(shí)有明顯的積累，于28?h達(dá)到最大值660?mg/L，之后逐步下降，到第60?h，亞硝酸鹽濃度降為50?mg/L。C3的硝酸鹽降解及生長(zhǎng)曲線符合好氧反硝化酶系理論，與已報(bào)道的好氧反硝化菌Diaphorobacter?sp.PDB3[10]相似。與Zhang等[16-17]報(bào)道反硝化細(xì)菌降解過(guò)程中也有亞硝酸鹽的積累不一致，可能是因?yàn)槌跏枷跛猁}降解為亞硝酸鹽的速率高于亞硝酸亞降解速率，隨硝酸鹽濃度降低，硝酸鹽降解為亞硝酸鹽的速率逐漸降低。

3?結(jié)論

（1）以苯酚為唯一碳源，NO3-為唯一氮源，從焦化廢水中篩選出了1株同時(shí)具有降解苯酚和反硝化能力的菌株C3，經(jīng)16SrDNA測(cè)序鑒定為Pseudomonas?sp.。

（2）C3降解苯酚的最優(yōu)條件為：pH?7.5、溫度30?℃、初始苯酚濃度1?000??mg/L、硝酸鹽氮濃度1.0?g/L，此時(shí)C3菌株的苯酚降解能力最高，在該條件下培養(yǎng)60?h后，C3苯酚降解率為89%，NO3-去除率達(dá)81%。

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