Toll樣受體2激動劑在疫苗研發(fā)中的研究進展

楊斯錦 潘超 朱力 王恒樑 馬蓮菊

摘要?Toll樣受體2（TLR2）是Toll樣家族中識別配體范圍最大的一類Toll樣受體（TLR），能夠識別包括脂蛋白、脂肽等成分在內(nèi)的多種配體。通過這些配體激活后的TLR2可以在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。通過簡要綜述近年來對TLR2配體激動劑作為潛在的疫苗佐劑及免疫類藥物方面的研究，發(fā)現(xiàn)其在免疫反應(yīng)過程中的優(yōu)勢將為解決疫苗研發(fā)中的多種挑戰(zhàn)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

關(guān)鍵詞?TLR2;免疫反應(yīng);疫苗佐劑

中圖分類號?R392文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0007-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research?Progress?of?Tolllike?Receptor?2?Agonists?in?Vaccine?Development

YANG?Sijin1，2，PAN?Chao2，ZHU?Li2?et?al

（1.?College?of?Life?Science，?Shenyang?Normal?University，Shenyang，Liaoning?110034;2.?Institute?of?Biological?Engineering，?Academy?of?Military?Medical?Sciences，Beijing?100071）

Abstract?Tolllike?receptor?2?（TLR2）?is?the?Tolllike?receptor?（TLR）?with?the?largest?range?of?recognition?ligands?in?the?Tolllike?family.?It?can?recognize?a?variety?of?ligands，?including?lipoproteins?and?lipopeptides.TLR2?activated?by?these?ligands?can?play?an?important?role?in?the?immune?system，?triggering?a?specific?immune?response.Through?a?brief?review?of?recent?studies?on?TLR2?ligand?agonists?as?potential?vaccine?adjuvants?and?immune?drugs，?it?is?found?that?their?advantages?in?the?immune?response?process?will?play?a?vital?role?in?solving?many?challenges?in?vaccine?development?.

Key?words?TLR2;Immune?response;Vaccine?adjuvant

基金項目?遼寧省教育廳基礎(chǔ)研究項目（LJC201912）。

作者簡介?楊斯錦（1995—），女，遼寧錦州人，碩士研究生，研究方向：資源與應(yīng)用微生物學(xué)。通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事資源與應(yīng)用微生物學(xué)研究。

收稿日期?2019-11-18

I型跨膜蛋白Toll樣受體（Toll?like?receptor，TLR）家族的TLR2是一類位于細胞表面，常與TLR1或TLR6形成異源二聚體的模式識別受體。當這類受體與其配體結(jié)合時，可以啟動先天性免疫反應(yīng)，進而激活特異性免疫系統(tǒng)。因此，可以識別TLR2的配體即為激活TLR2的激動劑，這些激動劑在疫苗的免疫應(yīng)答過程中起著重要作用。TLR2配體在免疫反應(yīng)中可以調(diào)節(jié)APC細胞的遷移及抗原的內(nèi)化、調(diào)控Ⅱ類MHC分子中抗原的加工和呈遞、誘導(dǎo)CD4+?T細胞的極化以及激活NK細胞活性等。由此可見，TLR2通過其配體激活可以啟動和傳導(dǎo)與免疫相關(guān)的多種細胞信號通路，這可以成為藥物開發(fā)和疾病預(yù)防的重要靶點[1]。

現(xiàn)研究表明，TLR2可以識別脂蛋白、脂多肽、脂磷壁酸、阿拉伯甘聚糖以及酵母多糖等多種成分[1]。TLR2通過對這些物質(zhì)激活的響應(yīng)，可以促進炎性細胞因子的產(chǎn)生并且誘導(dǎo)特異性免疫。

目前比較常見的疫苗主要為減毒活疫苗和滅活疫苗，然而這2種疫苗都存在著可能回復(fù)到致病形式或滅活不足的安全隱患，因此，佐劑的使用既可以增強免疫原性又可以減少抗原的總量和達到所需免疫水平的免疫次數(shù)。TLR2激動劑可廣泛應(yīng)用于疫苗的佐劑研究，以誘導(dǎo)長效而持久的免疫應(yīng)答[2]。為充分利用TLR2激動劑在免疫系統(tǒng)中的重要功能，現(xiàn)已將TLR2激動劑開發(fā)為潛在的疫苗佐劑及抗腫瘤類的藥物，例如從傳統(tǒng)來看，癌癥的常規(guī)治療方式為化學(xué)療法，即放射療法和手術(shù)相結(jié)合，雖然這種方法可以導(dǎo)致腫瘤的消退和生命的延長，但是這樣的技術(shù)是侵入性的，極易引發(fā)副作用并且這種治療形式大多數(shù)都是持久性的。近年來，免疫治療作為一種新的治療方式已經(jīng)引起人們的關(guān)注，其中TLR2及其激動劑已被用于抗原及免疫增強劑，旨在恢復(fù)和增強機體受損的免疫系統(tǒng)對抗癌癥，這些研究為開發(fā)用于治療疾?。ㄓ绕涫前┌Y）的新型免疫治療劑提供了巨大的潛力[3]。筆者主要通過對TLR2在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的過程及原理等方面進行分析，總結(jié)了其在疫苗研發(fā)中的重要作用。

1?TLR2及其配體

與膜相關(guān)的TLR是模式識別受體（pattern?recognition?receptors，PRRs）的一種，它們可以幫助先天性免疫系統(tǒng)感知微生物。由于病原體相關(guān)分子模式（PAMP）刺激PRRs在后續(xù)特異性免疫應(yīng)答的形成過程中起決定性的作用，包括抗原提呈細胞的成熟、初始T細胞的激活和炎性細胞因子的誘導(dǎo)，所以在PRRs配體中抗原的結(jié)合已成為一個重要的免疫學(xué)研究方向，而TLRs即為研究最廣泛的模式識別受體之一[4-5]。

在系統(tǒng)發(fā)育中，TLR2屬于TLR家族，它位于細胞表面，與其配體結(jié)合后，可以和同一家族的TLR發(fā)生二聚，在抗原提呈細胞（包括巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞）中表達。TLR2通常被描述為識別配體范圍最大的TLR，這些配體包括細菌細胞壁中的成分，如脂蛋白、肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）、某些細菌物種（如牙齦卟啉單胞菌）的脂多糖（LPS）、奈瑟菌的孔蛋白、分枝桿菌的脂蛋白-甘露聚糖和酵母聚糖以及酵母細胞壁中的磷酸脂甘露聚糖等[6]。將TLR2激動劑共價結(jié)合到抗原上，能夠使與TLR2靶向的脂質(zhì)分子結(jié)合的抗原直接或交叉呈遞表達過程增強、調(diào)節(jié)Th反應(yīng)的平衡，以及刺激TLR2的黏膜印跡特性，這些都有可能有利于幫助解決實際的疫苗問題。

2?依賴于細菌蛋白TLR激動劑的TLR2受體激活

通常認為TLR激動劑大多數(shù)都為非蛋白微生物成分，如脂多糖、寡核苷酸、脂肽。但是，越來越多的研究表明，許多細菌蛋白同樣可以激活TLR信號和免疫反應(yīng)。這些TLR激動劑的蛋白呈現(xiàn)了一些非蛋白TLR激動劑所沒有的獨特特性，包括蛋白佐劑可與蛋白抗原在基因上融合，保證佐劑和抗原在同一細胞內(nèi)的同時一同被運輸，從而更有效地激活先天和特異性免疫。

TLR2可以與TLR1或TLR6結(jié)合形成異二聚體，分別識別三?；鞍缀投；鞍譡6]。眾所周知，大部分的脂蛋白都位于外膜上，即使脂蛋白的濃度在非常低時也可以被TLR2所識別，迅速地啟動相應(yīng)的級聯(lián)信號，從而促進胞內(nèi)配體識別信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活下游信號通路，最終誘導(dǎo)促炎性細胞因子、抗炎性細胞因子和趨化因子的大量產(chǎn)生，并促進宿主免疫細胞的成熟與分化。

除脂蛋白外，TLR2還對包括脂多肽、脂壁酸、阿拉伯甘聚糖及酵母多糖在內(nèi)的多種微生物模式產(chǎn)生響應(yīng)，表明TLR2具有混雜的特性[6]。志賀氏菌和沙眼衣原體的外膜蛋白（OMPs）可以誘導(dǎo)TLR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些OMPs引起促炎細胞因子IL-12p70、TNF-α、IL-6在APC上誘導(dǎo)成熟標記，在體腔和黏膜腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性IgG和IgA，并協(xié)調(diào)細胞（Th1極化）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[7-9]。細菌空隙形成蛋白是另一種與TLR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的外膜蛋白，研究表明多種細菌的孔蛋白都被鑒定為TLR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活物，例如，痢疾志賀氏菌的Ⅰ型孔蛋白可以上調(diào)TLR2的表達，并通過對TLR2的刺激誘導(dǎo)T細胞的增殖和存活[10];在霍亂弧菌中阻斷作為PAMP的外膜孔蛋白OmpU對TLR2的激活，會影響M1相關(guān)促炎細胞因子的產(chǎn)生[11];乳酸奈瑟氏菌的PorB是TLR2的配體，二者的相互作用對于驅(qū)動TLR2/TLR1依賴性細胞應(yīng)答至關(guān)重要，并且被研究者認為是通過孔的表面暴露環(huán)區(qū)域發(fā)生的[12]，此外，門氏奈瑟氏菌的外膜蛋白也是天然存在的TLR2配體，并可以起到佐劑的作用[13];梭狀芽孢桿菌的FomA能夠誘導(dǎo)野生型原代B細胞中表達TLR2[14]等。這些蛋白都可以誘導(dǎo)促炎細胞因子，激活A(yù)PC進而誘導(dǎo)細胞和體液免疫反應(yīng)。除外膜蛋白外，其他多種不同類型的蛋白也表現(xiàn)出TLR2激動劑的功能。例如，流產(chǎn)布氏桿菌的重組布魯氏菌細胞表面蛋白（rBCSP31）可與TLR2和TLR4相互作用，誘導(dǎo)IL12-p40、TNF-α和IL-6。當用rBCSP31激活后，與野生型巨噬細胞相比，TLR2和TLR4缺陷型巨噬細胞分泌的細胞因子水平較低。進一步的研究表明，rBCSP31可以TLR2和TLR4依賴性方式誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，防止流產(chǎn)雙歧桿菌感染[6]。分支桿菌蛋白MymA同樣也是TLR2的激動劑，它可以誘導(dǎo)人單核細胞衍生出的巨噬細胞產(chǎn)生抗原提呈細胞的功能，包括上調(diào)CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表達，以及IL-12和TNF-α的分泌。除此之外，MymA還通過增加INF-γ的分泌使宿主對Th1的免疫反應(yīng)極化[15]。

3?通過靶向TLR2的制劑進行免疫調(diào)節(jié)

在開發(fā)亞單位疫苗的過程中，怎樣更好更合理地使用TLR激動劑依賴于對免疫刺激在特異性免疫機制中是如何被啟動的研究。通過PRR進行的先天激活在適應(yīng)性免疫的形成過程中起著核心作用。

研究表明，TLR配體可短暫降低DC細胞在炎癥部位的運動性，使DC細胞與抗原在炎癥部位的接觸時間延長[16-17]。此外，病原體的內(nèi)化也受炎癥部位的TLR激活的調(diào)節(jié)，通過響應(yīng)TLR配體的反應(yīng)，抗原的內(nèi)在化最初出現(xiàn)短暫的增加，然后是成熟DC的內(nèi)吞能力特征性降低，這與專門用于抗原加工和提呈的表型是一致的[18-20]。當刺激包括TLR2在內(nèi)的不同TLR時，都可以觀察到DC細胞運動的短暫減少和抗原內(nèi)化的增強[21]。

盡管仍然存在爭議，但越來越多的證據(jù)支持TLR激活在吞噬體成熟過程中起決定性作用，從而影響APCs對抗原攝取和加工處理的調(diào)控。Blander等[22-24]研究發(fā)現(xiàn)吞噬體成熟存在2種模式，一是組成型的，二是由TLR信號誘導(dǎo)和調(diào)控的。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，只有在存在TLR配體的吞噬體中存在吞噬體融合速度高于凋亡細胞吞噬作用速度的現(xiàn)象。除此之外，當抗原與TLR配體共價連接或與同一物理顆粒結(jié)合時，TLR激活對吞噬體成熟和MHCⅡ類負載的自主調(diào)控可以增強特異性免疫調(diào)控反應(yīng)，這充分證明TLR激活可以自主調(diào)控MHCⅡ類的負載并穩(wěn)定細胞表面的Ⅱ類MHC[23，25]。TLR2作為TLR家族的一員也不例外，在存在TLR2激動劑即當抗原與脂蛋白或脂肽共價連接時，體內(nèi)可以明顯觀察到抗體和細胞應(yīng)答的增加。

有關(guān)TLR2激活和在疫苗接種中使用TLR2靶向制劑最有爭議的一點就是在CD4+?T細胞極化過程中不同TLR配體的TLR激活結(jié)果不同。在Dillon等[26]提出的模型中受體的激活誘導(dǎo)了高水平的ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子c-Fos，抑制IL-12的產(chǎn)生并促進IL-10的分泌，從而有利于Th2反應(yīng)的響應(yīng)。此外，根據(jù)Imanishi等[27]的研究，TLR2配體對小鼠Th1細胞的刺激直接誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生以及在沒有TCR刺激的情況下細胞的存活和增殖;在其他的TLR配體中沒有觀察到相同現(xiàn)象，因此，研究者們認為被激活后的TLR2或使用由TLR2激動劑組成的佐劑通過APC激活有效誘導(dǎo)Th1反應(yīng)。研究證明，TLR2既起誘導(dǎo)作用，又起調(diào)節(jié)作用。通過激活TLR2，使它單獨發(fā)揮作用或與其他刺激物聯(lián)合使用，對體內(nèi)的免疫反應(yīng)機制具有重要影響。

現(xiàn)已證明NK細胞的活化依賴于TLR2是否被激活，活化的NK細胞在針對不同病毒和細菌的免疫應(yīng)答中起作用，這表明TLR2激動劑可以作為治療或預(yù)防性免疫調(diào)節(jié)中NK細胞活性誘導(dǎo)劑的可能性[28-32]。盡管對TLR2激動劑誘導(dǎo)NK細胞活化過程中所需要的輔助性細胞（DCs）和輔助性細胞因子仍有待商榷，但已證明了不同TLR2激動劑對NK細胞都具有激活作用，TLR2介導(dǎo)的NK活性激活已形成適應(yīng)性應(yīng)答，以及在召回應(yīng)答中激活NK細胞活性，這將會成為未來預(yù)防性疫苗開發(fā)的有趣研究。

此外，TLR2在抗體應(yīng)答發(fā)展中的特殊作用現(xiàn)在正在顯現(xiàn)，已經(jīng)證明TLR2對抗體分泌細胞的產(chǎn)生和壽命都有影響，因此，靶向TLR2的藥物制劑被廣泛描述為抗體應(yīng)答的良好誘導(dǎo)劑。

4?針對TLR2的免疫原性制劑

TLR2是先天性免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁。近年來，TLR2激動劑已經(jīng)被開發(fā)成為潛在的疫苗佐劑及抗腫瘤藥物。

在20世紀90年代報道了第一個用于與大腸桿菌中的細菌脂蛋白融合表達蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體，旨于開發(fā)疫苗。其中一些研究的唯一目的是在宿主細菌的表面展示抗原[33-34]，但也有一些研究是為了利用脂質(zhì)部分的輔助特性來誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對異嗜性抗原的反應(yīng)[35-36]。這些載體由來自細菌脂蛋白基因的部分或完整序列組成，其后為異源抗原的編碼序列。在這些嵌合結(jié)構(gòu)中用作伴侶或用作脂化信號源的脂蛋白中，包括銅綠假單胞菌的OprI脂蛋白，OprI基因在其末端通過克隆獲得多接頭修飾，通過修飾的結(jié)合脂蛋白在經(jīng)過誘導(dǎo)后存在于外膜中，在不使用佐劑的情況下用于產(chǎn)生抗體[35];結(jié)核分枝桿菌的大小為26?kDa的脂蛋白（Rv1411），酰化的Rv1411是一種有效的TLR2受體激動劑，它與一種免疫原性蛋白融合，構(gòu)建出的融合蛋白可以應(yīng)用于提供有效且廉價的新型抗結(jié)核疫苗[37];腦膜炎奈瑟氏球菌的Ag473脂蛋白，Chen等[38]確定將至少包含Ag473?N端40個殘基的序列與來自登革熱病毒的非脂免疫原融合，以實現(xiàn)高表達水平的重組脂質(zhì)免疫原，在而后的動物試驗研究中也證明這種脂質(zhì)免疫原能夠引發(fā)更強的抗體中和反應(yīng);OMP19脂蛋白，外膜脂蛋白OMP19與來自牛分支桿菌的MPB83抗原融合形成的嵌合蛋白可以成功表達并準確地定位在預(yù)期的亞細胞部分中[39];大腸桿菌的Braun脂蛋白[40-41];來自由大腸桿菌產(chǎn)生的大腸桿菌素質(zhì)粒中的大腸桿菌E2裂解脂蛋白[36];鰻弧菌的Wza脂蛋白[42]等。在這些脂蛋白中，除了來自結(jié)核分枝桿菌的Rv1411脂蛋白外，所有提及的脂蛋白均來自革蘭氏陰性細菌，并發(fā)現(xiàn)它們都錨定在外膜上。這些分子首先在細胞質(zhì)中表達為具有N末端信號肽的脂蛋白，然后通過Sec轉(zhuǎn)座子穿過內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到周質(zhì)側(cè)進行處理，最初的脂化步驟是通過硫醚鍵使二酰基甘油基團與位于成熟序列N端的半胱氨酸殘基結(jié)合，接著裂解信號肽，然后第3個酰基鏈通過酰胺鍵連接到同一半胱氨酸殘基的氨基上，成熟的脂蛋白通過Lol系統(tǒng)最終運輸并固定在外膜上。此外，還有一些使用脂蛋白作為同源抗原的疫苗制劑實例，這些疫苗制劑是從其天然宿主中提取或在其他表達宿主中產(chǎn)生的。

佐劑是能夠提高疫苗的有效性但不直接參與免疫保護反應(yīng)的物質(zhì)，它除了可以增強免疫原性外，還可減少抗原的總量和達到足夠免疫保護水平所需的免疫次數(shù)，因此，充分利用TLR激動劑可以誘導(dǎo)強效而持久的免疫應(yīng)答的特點，TLR激動劑可以作為潛在的疫苗佐劑。與脂類分子連接的肽的化學(xué)合成是另一種廣泛用于制備佐劑制劑的策略?？乖砦煌ㄟ^Pam3C和Pam2C模擬二?；腿；募毦|(zhì)分子，但是這種結(jié)構(gòu)也有許多不同的變體，包括單鏈棕櫚酰肽、更復(fù)雜的脂質(zhì)核心肽（LCP）和多抗原親脂性輔助載體（MALAC）系統(tǒng)[43]，如HIV疫苗中的脂肽佐劑等。

開發(fā)TLR2激動劑在尋找潛在的癌癥免疫刺激劑方面具有巨大的潛力。與傳統(tǒng)治療方法相比，腫瘤免疫治療因其潛在的特異性和無不良反應(yīng)而受到越來越多的關(guān)注。TLR2激動劑通過S-[2，3-雙（棕櫚酰氧基）丙基]-半胱氨酸（Pam2Cys）基序而產(chǎn)生的脂肽，具有強大的免疫刺激作用，這些激動劑通過一種提供“危險信號”的方法以激活針對腫瘤抗原的免疫系統(tǒng)[3]。最近，Du等[44]基于hTLR2-hTLR1-Pam3CSK4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計了一系列新的Pam3CSK4衍生物，合成并評估了其免疫刺激活性，在其研究中表明，人類和鼠類TLR2激動劑的活性與Pam3CSK4相當，包括IL-6表達水平升高、通過激活NF-kB信號通路，上調(diào)TNF-α和IL-6?mRNA的表達，促進DC細胞的成熟。另外一個需要考慮的要點是其中一些合成激動劑具有與典型細菌TLR2激動劑非常不同的肽和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此，TLR2的激活對其免疫調(diào)節(jié)特性的依賴仍有待研究。

5?小結(jié)

對TLR2的研究不僅提示了一些已有佐劑的效應(yīng)機制，也將其本身的激動劑充分利用到了疫苗的研究與開發(fā)中，TLR2激動劑作為一類新的免疫制劑，通過在免疫反應(yīng)中增強抗原呈遞、激活免疫細胞等作用，有助于解決當前疫苗研究中的許多挑戰(zhàn)。利用TLR2激動劑研發(fā)的疫苗佐劑和藥物既可以減少不良反應(yīng)的發(fā)生又可以更加精確的激活所需的免疫應(yīng)答。相信隨著對TLR2受體及其激動劑的更加深入研究，它在疫苗研發(fā)過程中將發(fā)揮出更加重要的作用。

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