腦泰方對腦出血大鼠腦組織鐵沉積致神經(jīng)細胞過氧化損傷的影響

曾勁松 喻堅柏 廖君 羅剛 唐寧 黃娟 李弘 葛金文

摘要：目的? 觀察腦泰方對大鼠腦出血后腦組織鐵沉積致神經(jīng)細胞過氧化損傷的影響，探討其作用機制。方法? 采用自體血注射法構(gòu)建SD大鼠腦出血模型，隨機分為模型組、腦泰方組、陽性對照組、假手術(shù)組，各組均于給藥7、14、28 d取材;HE染色觀察腦組織病理變化，采用Zea Longa 5級評分法進行神經(jīng)功能缺失評分，免疫組化檢測病灶腦組織鐵沉積量、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量，免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX-4）的表達。結(jié)果? 與假手術(shù)組同一時點比較，模型組大鼠腦組織TfR和Tf表達上調(diào)，GPX-4表達下調(diào)，GSH含量下降，鐵沉積量和MDA含量升高，神經(jīng)功能缺失評分升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）;MDA含量與鐵含量呈正相關(guān)，GSH含量及GPX-4水平與鐵含量呈負相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，腦泰方組和陽性對照組大鼠腦組織TfR、Tf表達下調(diào)，GPX-4表達上調(diào)，GSH含量升高，鐵沉積量、MDA含量降低，神經(jīng)功能缺失評分降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）;與陽性對照組比較，腦泰方組對大鼠腦組織MDA、GSH含量調(diào)節(jié)作用更強，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論? 腦泰方可抑制模型大鼠腦組織鐵輸入蛋白的表達，減輕神經(jīng)細胞鐵超載，增強細胞抗氧化能力而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞：腦泰方;腦出血;鐵沉積;過氧化損傷;鐵死亡;大鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0046-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908240

Effects of Naotai Formula on Peroxidative Injury of Nerve Cells Caused by Iron Deposition

in Brain Tissue of Rats after Intracerebral Hemorrhage

ZENG Jinsong1，2， YU Jianbai1， LIAO Jun2， LUO Gang1， TANG Ning1， HUANG Juan2， LI Hong2， GE Jinwen2

1. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Naotai Formula on peroxidation injury of nerve cells caused by iron deposition in brain tissue of rats after intracerebral hemorrhage; To discuss its mechanism of action. Methods Intracerebral hemorrhage model of SD rats was established by autologous blood injection. The rats were randomly divided into model group， Naotai Formula group， positive control group and sham-operation group. The samples were collected in three batches on 7， 14 and 28 d of administration. HE staining was used for histopathological observation; Zea Longa 5 grade scoring was used for neurological deficit; Immunohistochemical kit was used to detect iron content， malondialdehyde （MDA） content and glutathione （GSH） content in the brain tissue of the lesion; The expression levels of transferrin （Tf）， transferrin receptor （TfR）， glutathione peroxidase 4 （GPX-4） were detected by immunofluorescence technique. Results Compared with sham-operation group， expressions of TfR and Tf in brain tissues were up-regulated， GPX-4 expression was down-regulated， GSH content was down-regulated， iron deposition and MDA content increased， neurological deficit score increased in model group， with statistical significance （P<0.01， P<0.05）. MDA content was positively correlated with iron content， while GSH content and?GPX-4 level were negatively correlated with iron content， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， expressions of TfR and Tf in brain tissues were down-regulated， GPX-4 expression was up-regulated， GSH content was up-regulated， iron deposition and MDA content were down-regulated， HE staining pathological score and neurological deficit score were down-regulated in Naotai Formula group and positive control group， with statistical significance （P<0.01， P<0.05）. Compared with positive control group， Naotai Formula group had stronger regulation effect on contents of MDA and GSH， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Naotai Formula can inhibit the expression of iron-imported protein， reduce iron overload in nerve cells， enhance the antioxidant capacity of cells and then play a neuroprotective role.

Keywords： Naotai Formula; intracerebral hemorrhage; iron deposition; peroxidation injury; ferroptosis; rats

腦出血屬中醫(yī)學“中風”范疇，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。研究表明，腦出血后血腫中紅細胞裂解釋放的鐵離子可導致繼發(fā)性腦損傷，腦出血恢復期病灶腦組織中鐵含量仍持續(xù)高于正常，且沉積的鐵可被再次活化，造成繼發(fā)性腦損傷[1]。研究表明，一種由鐵超載誘發(fā)并以細胞抗氧化能力耗竭為特征的鐵死亡是腦出血后神經(jīng)元死亡的主要形式[2]。腦泰方是本研究團隊葛金文教授防治中風的專利處方。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方可有效改善腦缺血大鼠神經(jīng)元鐵代謝而發(fā)揮腦保護作用[3-4]，這與鐵死亡的核心機制相吻合?；诖?，本研究采用自體血注射法構(gòu)建SD大鼠腦出血模型，通過檢測腦組織鐵、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量及轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferring，Tf）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX-4）的表達，腦組織病理學觀察和神經(jīng)功能缺失評分，探討腦出血后鐵沉積與細胞過氧化損傷的相關(guān)性，并以鐵離子螯合劑去鐵胺作為陽性對照藥物，探討腦泰方對腦出血大鼠腦組織鐵沉積及其過氧化損傷的干預作用;以期對腦出血后繼發(fā)性腦損傷的病理機制提出新的認識，同時為腦泰方治療腦出血的科學性提供實驗依據(jù)，豐富中醫(yī)藥治療中風的現(xiàn)代生物學內(nèi)涵。

1? 材料與方法

1.1? 動物

健康成年SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%環(huán)境，通風換氣8～10次/h，高溫高壓滅菌飼料及純凈水飲食，各組單籠喂養(yǎng)。

1.2? 藥物

腦泰方（黃芪、川芎、地龍、僵蠶）4味中藥按8∶2∶3∶3比例配方，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)水煎等工藝制成浸膏粉，浸膏得率26.2%，每1 g浸膏粉相當于4 g原藥材，含阿魏酸4.58 mg、川芎嗪2.20 mg、黃芪甲苷11.21 mg。臨用時用生理鹽水調(diào)配成2 g原藥材/mL，以60 kg成年人每日劑量80 g原藥材為依據(jù)，大鼠給藥劑量按體表面積換算，2倍成人劑量為20 g/kg。去鐵胺，瑞士諾華，500 mg/瓶，批號SL1830，大鼠按0.1 g/kg腹腔注射。

1.3? 主要試劑與儀器

水合氯醛（批號20180110），天津市科密歐化學試劑有限公司;多聚甲醛（批號20170113），國藥集團化學試劑有限公司;PBS粉末（ZLI-9062），無錫傲銳東源生物科技有限公司;組織鐵含量試劑盒（批號20190615），南京建成生物工程研究所;MDA試劑盒（批號20190611），南京建成生物工程研究所;GSH試劑盒（批號20190603），南京建成生物工程研究所。TfRⅠ抗（批號201901），規(guī)格50 mL/瓶，Bio-Swamp公司;TfⅠ抗（批號00025495）， 規(guī)格：0.1 mL/瓶，Proteintech公司;GPX-4Ⅰ抗（批號201901），規(guī)格：50 mL/瓶，Bio-Swamp公司。WP8025型腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），KDS310 Plus納升級單通道微量注射泵（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），Enspire多功能酶標儀（美國Perkinelmer），BMJ-1n型病理組織包埋機（上海珂淮儀器有限公司），TS-12F型生物組織自動脫水機（上海華巖儀器設(shè)備有限公司），LKB-Ⅲ型超薄切片機（廣州華俊科技有限公司），OLYMPUS倒置顯微鏡和照相裝置（日本OLYMPUS），AUW120D型精密電子天平（日本Shimadzu），DW-HL-3985型美菱超低溫冰箱[中科美菱（合肥）低溫科技股份有限公司]，Z32HK臺式高速冷凍離心機（杭州英斯特科技有限公司），KS400型圖像分析儀（德國ZISSE）。

1.4? 造模

SD大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，使前囟和后囟處于同一水平。備皮后常規(guī)消毒，沿前囟旁開3 mm作10 mm縱行切口，切開頭皮及骨膜后暴露前囟，于前囟后方1 mm、旁開3 mm處用微型鉆作直徑1 mm小孔。消毒鼠尾后距末端0.5 cm處剪斷，取自體血50 μL，經(jīng)定位儀上微量注射器沿所鉆骨孔進針6 mm，即為右側(cè)尾狀核的位置，10 min內(nèi)注入自體血50 μL，注射完畢后停針5 min，緩慢退針，縫合切口。假手術(shù)模型制備步驟同上，不注入自體血，向大鼠尾狀核注入生理鹽水50 μL。

1.5? 分組

60只成模大鼠隨機分為模型組、腦泰方組、陽性對照組和假手術(shù)組，每組15只。單籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.6? 給藥

腦泰方組大鼠造模后24 h按20 g/kg給予腦泰方灌胃，陽性對照組大鼠按0.1 g/kg予去鐵胺腹腔注射，模型組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔注射。給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)28 d。

1.7? 取材

各組均于給藥7、14、28 d預定時間點，參照隨機數(shù)字表分別將其中5只大鼠作常規(guī)灌注固定后，斷頭取材。以注入針道為中心，冠狀切下厚約5 mm標本，10%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度5 μm），備用。

1.8? 指標檢測

1.8.1? 腦組織病理學檢測

取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察腦組織病理改變。

1.8.2? 神經(jīng)功能缺失評分

根據(jù)Zea Longa 5級評分法評定[5]。0分：無神經(jīng)損傷癥狀;1分：不能完全伸展對側(cè)前爪;2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向?qū)?cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.8.3? 腦組織鐵、丙二醛、谷胱甘肽含量測定

免疫組化試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.8.4? 免疫熒光檢測蛋白表達

使用相應(yīng)Ⅰ抗兔抗鼠抗體，嚴格按試劑盒說明書操作。每份標本隨機選取10個視野，用Image-proplus 6.0分析軟件進行陽性目標視場平均灰度值、面積密度測定，并換算成陽性單位（PU），以PU值代表陽性產(chǎn)物表達水平。用陽性反應(yīng)產(chǎn)物灰度級（Ga）、測試區(qū)域灰度級（GA）、面積（N）和背景面積（M）計算。PU=100×（Ga-GA）÷（1-N/M）×255。

1.9? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性時用LSD檢驗，方差非齊性時用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? 大鼠神經(jīng)功能缺失評分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，腦泰方組和陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯降低（P<0.05）;第7、14日腦泰方組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），第28日腦泰方組大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯高于陽性對照組（P<0.05），提示腦泰方與去鐵胺在腦出血早期均可改善大鼠腦損傷，但腦泰方遠期效果優(yōu)于去鐵胺。見表1。

2.2? 腦組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠血腫周圍腦組織出現(xiàn)明顯水腫、壞死，細胞排列不規(guī)則、疏松，細胞外間隙增大，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)細胞變性壞死，大量炎性細胞浸潤;與模型組比較，腦泰方組及陽性對照組大鼠腦組織腫脹減輕，神經(jīng)元水腫變性減少，炎癥細胞浸潤減輕，固縮細胞較少，細胞周圍間隙變小;假手術(shù)組腦組織無明顯病理改變，神經(jīng)細胞排列緊密整齊，神經(jīng)細胞胞體大，胞核淡染、大且圓，見圖1。

2.3? 腦泰方對模型大鼠腦組織鐵、丙二醛、谷胱甘肽含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織鐵含量持續(xù)升高，于第14日達到高峰，第28日仍明顯高于正常，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織MDA含量明顯升高，GSH含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）;鐵含量與MDA含量呈正相關(guān)（P<0.05），與GSH含量呈負相關(guān)（P<0.05）;與模型組比較，腦泰方組及陽性對照組大鼠腦組織鐵及MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）;與陽性對照組比較，腦泰方組對MDA、GSH含量調(diào)節(jié)作用更明顯，陽性對照組對鐵調(diào)節(jié)作用更明顯（P<0.05）。見表2。

2.4? 腦泰方對模型大鼠腦組織轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Tf、TfR蛋白表達明顯升高，GPX-4蛋白表達明顯降低（P<0.01，P<0.05），Tf第7日達高峰，第28日基本恢復正常，TfR第14日達高峰，第28日仍高于正常（P<0.05）;與模型組比較，腦泰方組和陽性對照組大鼠腦組織Tf、TfR蛋白表達明顯降低，腦泰方組GPX-4蛋白表達明顯升高（P<0.01，P<0.05）;第7、14日腦泰方組Tf、TfR蛋白表達高于陽性對照組（P<0.05），第14、28日腦泰方組GPX-4蛋白表達明顯高于陽性對照組（P<0.05）。見圖2、表3。

3? 討論

腦出血后伴隨血腫溶解及紅細胞破壞，腦組織間隙大量血紅蛋白聚集，并進一步通過氧化反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（ROS）及含鐵血紅素;含鐵血紅素在血紅素加氧酶作用下降解為鐵離子、膽綠素及一氧化碳[6]。腦間質(zhì)中鐵離子與Tf結(jié)合后，再與神經(jīng)細胞表面TfR結(jié)合進入細胞質(zhì)，以鐵蛋白的形式儲存。由此可見，腦出血后在血腫周圍腦間質(zhì)中有大量鐵聚集，腦間質(zhì)中的鐵主要經(jīng)Tf/TfR途徑向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而出現(xiàn)細胞內(nèi)鐵沉積現(xiàn)象。研究表明，腦出血后第3日開始出現(xiàn)病灶周圍腦組織鐵沉積，在出血后第28日鐵含量仍明顯高于對側(cè)正常腦組織[1]。另有研究者通過磁共振梯度回波成像跟蹤檢測腦出血患者腦鐵沉積變化，并結(jié)合實驗研究同步證實，腦出血后3個月病灶側(cè)鐵含量仍明顯高于對側(cè)腦組織[7]。本研究結(jié)果顯示，腦出血模型大鼠腦組織鐵含量持續(xù)升高，于第14日達到高峰，第28日時仍高于正常，這與上述研究結(jié)果一致。

鐵作為血腫降解的主要活性產(chǎn)物，主要通過氧化還原反應(yīng)迅速增加ROS的濃度，造成神經(jīng)細胞過氧化損傷[8]。這一生化過程與近年研究發(fā)現(xiàn)的鐵死亡機制密切相關(guān)。鐵死亡是一種由鐵離子超載誘發(fā)，以脂質(zhì)過氧化為特征的細胞死亡形式[9-10]。細胞內(nèi)超載的鐵離子通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS，使細胞內(nèi)主要的抗氧化損傷體系中GSH耗竭，GPX-4活性被抑制，細胞有氧代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GSH/GPX-4途徑清除，繼而與細胞內(nèi)超載的鐵離子以類似Fenton反應(yīng)的方式進一步產(chǎn)生大量脂質(zhì)ROS，大量脂質(zhì)ROS累積而使細胞發(fā)生鐵死亡。研究表明，通過干預Tf及TfR蛋白表達，可調(diào)控細胞鐵死亡[11]。GSH/GPX-4是細胞發(fā)揮抗氧化作用的核心體系，GPX-4是一種GSH依賴性酶，被證實是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控分子[12]。GSH、GPX-4及Tf、TfR為調(diào)控鐵死亡的主要信號分子。本研究在檢測腦組織鐵沉積量的同時，同步檢測GSH及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，分析鐵沉積與鐵死亡的相關(guān)性，結(jié)果顯示，鐵沉積量與GSH呈負相關(guān)，與MDA呈正相關(guān)，提示鐵沉積是腦出血后鐵死亡發(fā)生的主要原因。

近年來，一些中藥復方或單體被證實可調(diào)節(jié)鐵代謝而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，如黃芪多糖可減輕間充質(zhì)干細胞鐵超載所致神經(jīng)功能障礙[13];淫羊藿、黃芪、葛根提取物均可減輕神經(jīng)細胞鐵超載[14];黃芩素可減輕鐵沉積和脂質(zhì)過氧化而抑制細胞鐵死亡[15]。腦泰方是本團隊多年應(yīng)用于臨床治療腦卒中的經(jīng)驗方，課題組對其進行了多項臨床及實驗研究。方中黃芪大補脾胃之氣為君藥，令氣旺血活，血活則瘀除，其有效成分為黃芪甲苷;川芎活血行氣，氣行則血行，是為臣藥，其活性成分為川芎嗪、阿魏酸;地龍、僵蠶通經(jīng)活絡(luò)、化痰熄風，均為佐藥，有效成分為地龍肽、促蛻皮甾醇等。諸藥合用共奏益氣活血通絡(luò)、祛風化痰之效，切合腦出血以虛、瘀為主的中醫(yī)病機。本研究基于前期腦泰方調(diào)節(jié)鐵代謝而發(fā)揮神經(jīng)保護作用的研究基礎(chǔ)，以鐵離子螯合劑去鐵胺作為陽性對照藥物，通過檢測Tf、TfR及GPX-4的表達水平，探討腦泰方對腦出血大鼠腦組織鐵沉積及其過氧化損傷的干預作用;結(jié)果顯示，腦泰方可明顯下調(diào)TfR、Tf水平，上調(diào)GPX-4水平，促進GSH合成，降低鐵和MDA含量。減輕腦組織病理損傷及神經(jīng)功能缺失;其在調(diào)節(jié)鐵代謝方面，起效時間和強度弱于去鐵胺，但對GSH及GPX-4調(diào)節(jié)作用優(yōu)于去鐵胺，第28日組織病理學改變及神經(jīng)功能缺失評分優(yōu)于去鐵胺。這與前期腦出血后去鐵胺神經(jīng)保護作用研究結(jié)果[16-17]一致。

從腦泰方與去鐵胺的效果差異推測，腦泰方還有可能通過其他途徑提高GSH、GPX-4水平，從而提高細胞的抗氧化能力，如調(diào)節(jié)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體的活性影響谷氨酸代謝亦為鐵死亡的調(diào)節(jié)途徑之一，前期研究表明，腦泰方可降低腦組織內(nèi)興奮性氨基酸毒性，提高細胞抗氧化能力[18]，今后我們將以此為靶向開展進一步研究。

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（收稿日期：2019-08-16）

（修回日期：2019-10-04;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81774174、81774033）;湖南省中醫(yī)藥科研項目（201969）;湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合一流學科開放基金（2018ZXYJH15）

通訊作者：葛金文，E-mail：40831556@qq.com