補陽還五湯對Cav-1-/-小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達的影響

陳博威 周勝強 易健 張文將 劉柏炎

摘要：目的? 觀察補陽還五湯對Cav-1-/-小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達的影響，探討其可能的作用機制。方法? 將野生型小鼠（WT）及Cav-1-/-小鼠（KO）隨機分為假手術組、模型組與補陽組。采用大腦中動脈栓塞法制備腦缺血模型，干預10 d后運用Ayelet Levy 14分評分法觀察小鼠神經功能評分。免疫組化和qRT-PCR分別檢測小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的表達。結果? 與假手術組比較，各模型組小鼠均出現明顯神經功能障礙（P<0.01），且PI3K、Akt蛋白和mRNA表達明顯升高（P<0.01），PTEN蛋白和mRNA表達明顯降低（P<0.01），WT模型組小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA表達更顯著，且神經功能評分優(yōu)于KO模型組（P<0.01，P<0.05）;WT補陽組小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的調控程度及神經功能恢復程度均優(yōu)于WT模型組和KO補陽組（P<0.01）。結論? 補陽還五湯可能通過Cav-1調控PI3K/Akt信號通路活性，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

關鍵詞：補陽還五湯;腦缺血;PI3K/Akt信號通路;Cav-1基因敲除;小鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0035-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910455

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Expressions of PI3K， Akt， PTEN

in Cav-1-/- Mice after Cerebral Ischemia

CHEN Bowei1， ZHOU Shengqiang2， Yi Jian3， ZHANG Wenjiang1，4， LIU Baiyan1，4

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China;

2. Affiliated Hospital of Hunan Provincial Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;

4. Yiyang Medical College， Yiyang 413000， China

Abstract： Objective To observe the effects of Buyang Huanwu Decoction on expressions of PI3K， Akt and PTEN after cerebral ischemia in Cav-1-/-mice; To discuss its possible mechanism. Methods Wild type mice （WT） and Cav-1-/-mice （KO） were randomly divided into sham-operation group， model group and Buyang Huanwu Decoction group. Cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion. After 10 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed by Ayelet Levy 14 points. Immunohistochemistry and qRT-PCR were used to detect the expressions of PI3K， Akt， PTEN protein and mRNA. Results Compared with sham-operation group， there were obvious neurological dysfunction in each model group （P<0.01）， and the expressions of PI3K， Akt protein and mRNA increased significantly （P<0.01）， PTEN protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Besides， PI3K， Akt， PTEN proteins and mRNA expression in WT model group was more significant and the neurological function score was better than that of KO model group （P<0.01， P<0.05）. In addition， the degree of protein and mRNA regulation and neurological function recovery in WT Buyang Huanwu Decoction group?was better than that in WT model group and KO Buyang Huanwu Decoction group （P<0.01）. Conclusion Buyang Huanwu Decoction may play an anti-cerebral ischemic injury role by regulating the activity of PI3K/Akt signaling pathway through Cav-1.

Keywords： Buyang Huanwu Decoction; cerebral ischemia; PI3K/Akt signaling pathway; Cav-1 gene knockout; mice

缺血性腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會、家庭及個人帶來沉重的痛苦和負擔[1]。課題組前期研究發(fā)現，Cav-1在腦缺血損傷中可抑制炎癥反應、降低缺血側半暗帶自噬及促進血管新生[2-4]，達到促進神經恢復的作用。PI3K/Akt信號通路是一條能調控細胞生長、分化及自噬的經典通路，對腦缺血損傷具有保護作用[5]。有研究表明，Cav-1可通過調控PI3K/Akt通路治療疾病[6-7]，但Cav-1是否調控PI3K/Akt通路對腦缺血后腦保護作用產生影響，迄今未見報道。補陽還五湯為治療缺血性中風氣虛血瘀證的經典名方，其療效已被臨床證實[8]。本研究以Cav-1基因敲除小鼠作為研究對象，通過觀察腦缺血小鼠神經功能評分與PI3K/Akt通路相關指標的蛋白與mRNA變化，探討補陽還五湯干預腦缺血小鼠的作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

健康雄性Cav-1-/-小鼠（KO）與同源野生型C57（WT）小鼠各40只。其中Cav-1-/-小鼠購自美國Jackson Laboratory，批號2909619，湖南中醫(yī)藥大學動物中心自行繁衍，均經PCR鑒定為Cav-1基因敲除[9]，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

補陽還五湯（黃芪120 g，當歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。常規(guī)煎煮后濃縮至含2 g原藥材/mL，冷藏備用。

1.3? 主要試劑與儀器

PI3K抗體、Akt抗體、PTEN抗體、SABC-POD試劑盒（武漢博士德公司，批號依次為BA1353-1、BA1512、BM4114、SA1022）。EG1150H石蠟包埋機（德國萊卡公司），RM2235切片機（德國萊卡公司），BX71顯微鏡（日本奧林巴斯公司），TRIzol Reagent（美國Life Technologies公司），Rever tAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo公司），PCR引物（上海生工合成），PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司），核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），核酸蛋白濃度測定儀（英國BIO-DROP公司）。

2? 實驗方法

2.1? 分組、造模與給藥

將KO組和WT組按隨機數字表法分為假手術組、模型組及補陽組，運用大腦中動脈栓塞法復制腦缺血模型，每組12只。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側頸總、頸內、頸外動脈，依次結扎頸總、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方0.2～0.3 cm處剪一小口，將魚線通過頸總動脈，插入頸內動脈，遇輕微阻力后停止進線，深度（7.5±0.5）mm，固定魚線并逐層縫合。假手術組僅切開皮膚、分離頸內、頸外動脈后即縫合。術后2 h參照Longa等[10]5分法進行神經功能評分。分值在1～3分表明造模成功，予以納入研究。補陽組術后2 h給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動物體質量藥量折算表換算）補陽還五湯藥液，灌胃體積按0.2 mL/10 g體質量，模型組和假手術組動物均給予等體積蒸餾水。每日1次，連續(xù)10 d。

2.2? 檢測指標

2.2.1? 神經功能評分

運用Ayelet Levy 14分評分法[11]評估神經功能。①提住尾巴將小鼠逐漸提高：前肢屈曲計1分，后肢屈曲計1分，30 s內頭移動與縱軸形成角度>10°計1分;②將大鼠置于地面：正常爬行計0分，無法直線爬行計1分，沿患側轉圈計2分，患側跌倒計3分;③梁平衡測試：靜態(tài)姿勢下可平衡計0分，抓握梁邊計1分，抱住梁、有一肢體掉落計2分，抱住梁、有兩肢體掉落，或在梁上旋轉（>60 s）計3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>40 s）計4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計5分，跌落且沒有試圖保持平衡或抓梁（<20 s）計6分;④反射缺失或異常動作：耳廓反射（當觸耳道時搖頭）計1分，角膜反射（用棉花絲輕觸角膜可閉眼）計1分。

2.2.2? 免疫組化檢測蛋白表達

小鼠處死后，4%多聚甲醛固定大腦，脫水，常規(guī)包埋，切片，厚度約4 μm，依次烤片、脫蠟水化，3%過氧化氫去離子水滅活，熱修復抗原，BSA封閉液封閉，適量一抗4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗后二抗孵育，再次PBS沖洗，滴加SABC孵育，最后DAB顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，光學顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞數。另因一抗特性不同，PTEN在DAB染色后再用蘇木素復染，光學顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運行ImagePro Plus6.0圖像分析軟件計算平均光密度。

2.2.3? qRT-PCR檢測mRNA表達

從引物銀行下載基因序列，用Primer premier 6.0進行引物設計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。運用Trizol法提取腦組織總RNA;檢測RNA濃度及質量;兩步法反轉錄cDNA;PCR反應：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火58.2～60.8 ℃，40個循環(huán)。溶解曲線反應程序：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，溫度緩慢上升（20 min）。β-actin為內參基因，用2-ΔΔCt進行相對定量，表示該基因相對表達量。ΔCt值=基因Ct值-內參Ct值，ΔΔCt值=實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism 8作圖軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，符合正態(tài)性分布，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? 補陽還五湯對模型小鼠神經功能的影響

假手術組小鼠無神經功能障礙;各模型組小鼠出現明顯神經功能障礙（P<0.01），且KO比WT神經功能損傷更嚴重（P<0.05）;補陽組小鼠神經功能評分較模型組明顯降低（P<0.05，P<0.01），但KO補陽組效果差于WT補陽組（P<0.01）。見表2。

4.2? 補陽還五湯對模型小鼠PI3K、Akt、PTEN蛋白表達的影響

與假手術組比較，KO模型組較WT模型組小鼠PI3K、Akt蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），PTEN蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與KO比較，WT變化更顯著（P<0.05，P<0.01）;與WT模型組比較，WT補陽組各蛋白表達變化更顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而KO補陽組調控程度不及WT補陽組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1～圖6。

4.3? 補陽還五湯對模型小鼠PI3K、Akt、PTEN mRNA表達的影響

與假手術組比較，KO模型組與WT模型組PI3K、Akt mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），PTEN mRNA表達明顯降低（P<0.01），與KO比較，WT變化更顯著（P<0.05，P<0.01）。WT補陽組與WT模型組比較，各指標表達的變化更顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而KO補陽組調控程度不及WT補陽組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），與蛋白表達相似。見圖7。

5? 討論

補陽還五湯由王清任所創(chuàng)，常用于治療缺血性中風氣虛血瘀之證。王氏認為元氣藏于身體“氣管之內，分布周身，左右各得一半”，中風后半身不遂是因元氣虧損，則“經絡自然空虛，有空虛之隙，難免其氣向一邊歸并”，若元氣只剩下五成，致元氣歸于半身而致對側半身不遂。因此治療上需補充虧損半身的五成元氣。所謂“補陽”即補氣，氣為陽，“還五”即恢復半身虧損的元氣，由此可保證全身元氣十足，恢復偏癱肢體。王氏指出“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，氣虛血行不利，必導致血瘀。本方重用黃芪為君藥，以大補元氣;配以當歸尾活血和血，為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當歸活血祛瘀，地龍長于行散走竄，通經活絡，均為佐藥。諸藥合用，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。課題組前期研究表明，補陽還五湯能在腦缺血后通過降低炎癥反應[12]、抑制細胞凋亡[13]、促進血管新生[4]、減少細胞自噬[14]等途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

PI3K/Akt通路是細胞一條關鍵的信號通路，廣泛參與調控細胞增殖、分化及凋亡的各個過程[5]。腦缺血后機體受到刺激會釋放各類酪氨酸激酶活性受體激活的物質，這些受體能特異性活化PI3K，當PI3K激活后，會將PIP2轉化成PIP3，激活AKt。Akt作為一種重要的信息分子，不僅能繼續(xù)激活下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號因子及B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）等調節(jié)細胞生長、自噬與凋亡[15]，還能通過減少腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的釋放減輕腦缺血后炎癥損傷[16]。而PTEN能逆轉PIP2向PIP3的轉化，起到對整個通路的負性調控作用[17]。另有研究表明，PI3K/AKt信號通路還能在腦缺血后通過誘導神經再生[18]、抑制氧化應激[19]、促進血管新生[20]等方式，在腦缺血后恢復中扮演重要角色。本實驗發(fā)現，腦缺血后小鼠PI3K、Akt的蛋白及mRNA表達上升，PTEN的蛋白及mRNA表達被抑制，但整體活化程度有限，無法完全修復受損神經，仍有明顯神經功能缺損。補陽還五湯的干預使相關蛋白調控作用更明顯，并能顯著改善神經功能。我們推測補陽還五湯可能通過調控PI3K/Akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

小窩是一種特殊形式的脂筏，位于細胞膜表面的特異性凹陷區(qū)，在神經元及膠質細胞膜上有豐富的表達。Cav-1是小窩中重要的功能結構與核心蛋白，通過“腳手架結構區(qū)”可與下游各類效應因子結合，廣泛參與細胞生長、分化、凋亡等病理生理過程[21]。課題組前期發(fā)現，Cav-1是治療中風的潛在靶點：正常腦內有少量Cav-1表達，腦缺血后Cav-1迅速增加，Cav-1-/-小鼠腦梗死面積縮小速度明顯低于正常小鼠，神經功能恢復也明顯減緩[22];Cav-1敲除可降低缺血腦組織血管新生[4]及神經干細胞的增殖[23]。有研究表明，PI3K/Akt通路存在于小窩中并受到Cav-1的調控，抑制Cav-1可呈量效關系減弱Akt的活化[24]。也有研究表明，Cav-1能阻斷PI3K/Akt通路來抑制胰腺癌的生長，并且Cav-1還可通過抑制神經酰胺的釋放[25]，激活Akt信號通路，阻止細胞凋亡。據此，我們推測Cav-1可能通過調控PI3K/Akt通路發(fā)揮抗腦缺血的作用。本實驗發(fā)現，補陽還五湯能改善腦缺血后的神經功能，其機制可能與調控PI3K/Akt通路有關。同時KO與WT比較，小鼠腦缺血后神經功能評分改善較低，PI3K/Akt通路相關因子表達受損，提示補陽還五湯可能是通過Cav-1調控PI3K/Akt信號通路的活性，促進神經恢復。

綜上所述，本研究初步發(fā)現補陽還五湯可能通過Cav-1調控PI3K/Akt信號通路的活性發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，但目前尚無法確定其作用機制與PI3K/Akt信號通路上調相關。今后課題組將采取Cav-1基因敲除及PI3K/Akt抑制劑雙重阻斷Cav1/PI3K/Akt信號通路的方式，希望進一步明確補陽還五湯抗腦缺血損傷的作用機制。

參考文獻：

[1] BENJAMIN E， BLAHA M， CHIUVE S， et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2017，131（4）：e29.

[2] 黃素芬，周勝強，羅東，等.陷窩蛋白-1對永久性大腦中動脈閉塞小鼠缺血皮質白細胞介素-1β和白細胞介素-6表達的影響[J].國際腦血管病雜志，2016，24（11）：1022-1027.

[3] 周勝強.補陽還五湯調控Cav1/mTOR/ULK1通路介導的自噬抗腦缺血損傷機制研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2017.

[4] 王華.補陽還五湯對caveolin-1敲除小鼠腦缺血后血管新生的作用及機理研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2014.

[5] 匡巍，余昌胤.磷脂酰肌醇-3磷酸激酶/AKT/雷帕霉素靶蛋白信號通路參與中樞神經損傷保護與修復的研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2018，22（2）：215-219.

[6] 丁珊珊，康潔，張凌媛，等.二陳湯對脂代謝紊亂小鼠Cav-1和PI3K/AKT表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（1）：242-244.

[7] 王曉輝，李非，鄭亞民，等.caveolin-1通過阻斷PI3K/Akt信號的激活抑制胰腺癌細胞增殖[J].中國普外基礎與臨床雜志，2011，18（10）：1054-1059.

[8] HAO C Z， WU F， SHEN J， et al. Clinical efficacy and safety of Buyang Huanwu decoction for acute ischemic stroke：a systematic review and meta-analysis of 19 randomized controlled trials[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：630124.

[9] 周勝強，羅東，黃素芬，等.Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鑒定及繁育方法[J].中國實驗動物學報，2016，24（3）：228-232.

[10] LONGA E， WEINSTEIN P， CARLSON S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84.

[11] LEVY A， BERCOVICH-KINORI A， ALEXANDROVICH A G， et al. CD38 facilitates recovery from traumatic brain injury[J]. Journal of Neurotrauma，2009，26（9）：1521-1533.

[12] 郭樂，周賽男，藺曉源，等.補陽還五湯對腦缺血后大鼠NF-κB/p50表達的影響[J].中醫(yī)藥信息，2014，31（4）：98-101.

[13] 廖亮英，蔡光先，周賽男.補陽還五湯超微飲片對局灶性腦缺血大鼠神經干細胞移植后Bcl-2、Bax表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報， 2018，38（3）：257-260.

[14] 周勝強，易健，周賽男，等.補陽還五湯對局灶性腦缺血小鼠半暗帶細胞自噬水平的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33（2）：119-123.

[15] 仇志富，顏勇，吳曉光.PI3K/Akt信號轉導通路與神經細胞凋亡研究進展[J].中風與神經疾病雜志，2015，32（10）：952-953.

[16] 涂獻坤，楊濱，涂德文，等.PI3K/Akt通路在丙泊酚減輕大鼠腦缺血性損傷中的作用[J].中國藥理學通報，2019，35（5）：630-633.

[17] GEORGESCU M. PTEN tumor suppressor network in PI3K-Akt pathway control[J]. Genes & Cancer，2010，12：1170-1177.

[18] 劉馨雨.人參皂苷Rd通過激活PI3K/Akt通路促進腦缺血/再灌注大鼠神經發(fā)生的作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2015.

[19] 孫明爍.通心絡通過PI3K/Akt通路對大鼠腦缺血再灌注損傷的治療作用及其機制研究[D].長春：吉林大學，2018.

[20] 李磊，高絢照，馬連萍，等.積雪草苷通過激活PI3K/Akt信號通路緩解局灶性腦梗死大鼠腦組織損傷和誘導血管新生[J].中國免疫學雜志， 2019，35（17）：2068-2072.

[21] KARAJEWSKA W M， MASTOWSKA I. Caveolins：structure and function in signal transduction[J]. Cellular & Molecular Biology Letters， 2004，9（2）：195-220.

[22] 劉柏炎，沈劍剛，蔡光先，等.補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠腦內caveolin1、2的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2008，28（1）：22-24.

[23] 周勝強，易健，劉柏炎.補陽還五湯對Cav1/Notch1/Hes1通路在小鼠腦缺血后海馬NSCs增殖中的作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2016， 27（6）：804-810.

[24] GUO Z， HU X， XING Z， et al. Baicalein inhibits prostate cancer cell growth and metastasis via the caveolin-1/AKT/mTOR pathway[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，2015，406（1/2）：111-119.

[25] WU P， QI B， ZHU H， et al. Suppression of staurosporine-mediated apoptosis in Hs578T breast cells through inhibition of neutral- sphingomyelinase by caveolin-1[J]. Cancer Letters，2007，256（1）：72.

（收稿日期：2019-10-29）

（修回日期：2019-11-19;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81273989）;湖南省自然科學基金（2018JJ2413）;湖南省中醫(yī)藥管理局項目（2015140）

通訊作者：劉柏炎，E-mail：liubaiyan@126.com