非剛竹屬5種竹子叢枝病病原菌的分離和鑒定

耿顯勝 舒金平 盛建立 張 威 彭 瀚

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所 杭州 311400； 2. 杭州市富陽區(qū)大源鎮(zhèn)林業(yè)管理站 杭州 311400)

竹子是禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)竹類植物的總稱，全世界有1 400多種。我國是世界上竹子分布最廣、種類最多的國家之一，竹林總面積約340萬hm2，竹類植物達500多種(Daietal.， 2016; Clarketal.， 2015; 江澤慧, 2002)。竹子是重要的森林資源之一，具有生長和成林速度快、產(chǎn)量高、再生能力強、經(jīng)濟價值高等特點，深受林農(nóng)歡迎而得到大面積推廣種植；然而，在竹子生產(chǎn)經(jīng)營和種質資源保存過程中，竹子病害常年發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，在我國有186種病原菌造成140多種竹子病害，包括叢枝病、枯梢病、基腐病、稈褐腐病、葉銹病、稈銹病、黑粉病、赤團子病、黑痣病等(徐梅卿等, 2006)，其中以竹子叢枝病發(fā)生最為普遍。叢枝病會造成竹子長勢衰弱、出筍減少，嚴重者甚至整株枯死，影響了竹子生長和竹林的可持續(xù)經(jīng)營(Kaoetal.， 1976; 江澤慧, 2002)。

在中國、日本、印度和韓國，均有竹子叢枝病發(fā)生的報道，且早期報道僅局限于剛竹屬(Phyllostachys)竹種。Tsuda等(1997)對日本竹種園叢枝病進行調查發(fā)現(xiàn)，倭竹屬(Shibataea)、業(yè)平竹屬(Semiarundinaria)、苦竹屬(Pleioblastus)和赤竹屬(Sasa)竹種也會感染叢枝病，其后又有學者在短穗竹屬(Brachystachyum)、牡竹屬(Dendrocalamus)、茶竿竹屬(Pseudosasa)和巴山木竹屬(Bashania)竹種上發(fā)現(xiàn)叢枝病，從而將病原菌的寄主范圍延伸到9個屬的竹種(Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009; 耿顯勝等, 2017a)。引起竹子叢枝病的病源菌很多，自1908年首次分離和鑒定竹子叢枝病病原菌以來，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的病原菌有竹針孢座囊菌(Aciculosporiumtake)、植原體(CandidatusPhytoplasma)、箬竹異香柱菌(Heteroepichloёsasae)、箣竹異香柱菌(Heteroepichloёbambusae)和竹暗球腔菌(Phaeosphaeriabambusae)5類(楊永剛等, 2011)。病原菌的寄主范圍分析表明，剛竹屬竹種叢枝病的病原菌主要是竹針孢座囊菌，而非剛竹屬竹種除針孢座囊菌外，植原體、箣竹異香柱菌、箬竹異香柱菌也會使其發(fā)病(Tsudaetal.， 1997; Tanakaetal.， 2002; Suryanarayanaetal.， 2009; Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009)。因此，對非剛竹屬竹種叢枝病病原菌進行鑒定，有助于明確非剛竹屬竹種病害發(fā)生的本質，為病害的科學防控提供指導。

本研究在浙江省廟山塢竹種園和云南省西雙版納傣族自治州中國科學院西雙版納熱帶植物園采集茶竿竹屬、巴山木竹屬、業(yè)平竹屬、牡竹屬和綠竹屬(Dendrocalamopsis)5種發(fā)生叢枝病的竹子樣品，采用組織分離法從5種樣品上分離病原菌，依據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，結合分子生物學方法對病原菌進行物種鑒定，并基于ITS rDNA(internal transcribed spacer sequences of ribosomal DNA, ITS rDNA)和LSU rDNA(nuclear large subunit ribosomal DNA, LSU rDNA)序列探討病原菌與麥角菌科(Clavicepitaceae)其他真菌間的系統(tǒng)發(fā)育關系,以期為竹子叢枝病病原菌的鑒定、病害的防控和麥角菌科物種間親緣關系的確定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年5月，在浙江省廟山塢竹種園(120°0′35″E，30°5′54″N)采集中華業(yè)平竹(Semiarundinariasinica)、巴山木竹(Bashaniafargesii)和薄籜茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.tenuis)樣品各6份，其中5份為表現(xiàn)叢枝病癥狀樣品，1份為健康樣品。2017年9月，在中國科學院西雙版納熱帶植物園(101°15′9″E，21°55′49″N)采集牡竹(Dendrocalamusstrictus)和黃麻竹(Dendrocalamopsisstenoaurita)樣品，其中牡竹為5份感病樣品和1份健康樣品，黃麻竹為1份感病樣品和1份健康樣品。樣品編號后置于自封袋中，帶回實驗室。每份樣品取部分提取DNA，剩余用于病原菌分離。試驗中用到的泡桐(Paulownia)叢枝病樣品采集自中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所試驗林地，竹針孢座囊菌標準菌株購買于中國林業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 5種感病竹子植原體病原檢測

采集的5種竹子叢枝病樣品和健康樣品以及泡桐叢枝病樣品，使用天根植物基因組提取試劑盒(DP305)提取總DNA。從總DNA中取1 μL用作PCR擴增的模板，采用引物對R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2(表1)進行巢式PCR擴增，以檢測樣品是否存在植原體病原。巢式PCR擴增的反應體系和條件同耿顯勝等(2017b)。

表1 引物名稱和序列Tab.1 Primer name and sequence

1.3 5種感病竹子病原菌的分離、形態(tài)結構和培養(yǎng)性狀觀察

采集的5種竹子叢枝病樣品在流水下沖洗2 h，用無菌剪刀將其剪成小段，依次使用75% 乙醇洗滌30 s、10% 次氯酸鈉洗滌10 min、無菌水洗滌5次。洗滌后將樣品轉移到無菌濾紙上，吸干表面殘留水分，轉接到含鏈霉素(200 mg·L-1)的PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)，觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和生長狀況。

菌落大小使用毫米刻度尺測量，病原菌菌絲和分生孢子使用VHX5000顯微鏡觀測，在觀察中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹病原菌的分生孢子前，使用麥氏試劑(Melzer’s reagent)(Leonard, 2006)對PDA平板上的病原菌進行染色。

1.4 5種感病竹子病原菌總DNA的提取、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

使用無菌吸頭從PDA平板上刮取分離培養(yǎng)和購買的病原菌菌絲或分生孢子，轉移到2 mL離心管中，充分研磨粉碎，使用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA。采用引物對LR0R/LR5(表1)擴增病原菌LSU rDNA的D1—D2區(qū)域約900 bp片段(Eberhard, 2012)。PCR擴增使用的反應體系為： 2 × PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1的正、反向引物各0.5 μL，模板1 μL，加ddH2O 補足20 μL。PCR的反應條件為： 95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性35 s，52 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s； 72 ℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)35。采用引物對ITS1F/ITS4(表1)擴增病原菌ITS rDNA序列約600 bp片段，PCR擴增使用的反應體系和條件同耿顯勝等(2017b)。取5 μL PCR產(chǎn)物，使用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，電泳結束后在凝膠成像儀上照相記錄結果。

PCR擴增陽性產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。測序序列使用DNAMAN 6.0進行比對分析，確定序列之間的同源性；使用BLASTN進行在線比對分析，在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到并下載與其具有很高相似性的麥角菌科真菌序列。測定的序列以及網(wǎng)上下載的序列使用MEGA 6.0(Tamuraetal.， 2013)進行序列比對，刪除兩端不整齊的序列，采用鄰位相連法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。另外，在構建系統(tǒng)發(fā)育樹時，選擇球囊孢殼屬(Heleococcum)的日本球囊孢殼菌(H.japonicum)作為外群。

2 結果與分析

2.1 5種感病竹子植原體病原檢測結果

本研究提取了5種竹子叢枝病樣品和健康樣品以及泡桐叢枝病樣品的總DNA，共計27份。采用引物對R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2對提取的總DNA進行巢式PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠進行電泳分析。結果發(fā)現(xiàn)，感病泡桐總DNA樣品能夠擴增出約1 200 bp的條帶，而所有5種竹子總DNA樣品均不能夠擴增出清晰的約1 200 bp的條帶(圖1A、B)，這表明竹子總DNA樣品中沒有植原體DNA存在，即本研究中5種竹子叢枝病的病原菌非植原體。

2.2 5種感病竹子病原菌的分離、形態(tài)結構和培養(yǎng)性狀

采用組織分離法，從中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病組織中分離到12株病原菌。表面消毒后的外植體在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3天后，長出米白色物質，將其轉接到PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，直到形成較大的菌落。該菌落正面為淺黃色，表面具有凹凸不平的褶皺、略有光澤、邊緣不整齊(圖2A、B)，與購買的竹針孢座囊菌標準菌株的菌落特征一致。VHX5000顯微鏡下觀察，該菌落為病原菌的分生孢子。分生孢子通過麥氏試劑染色發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基被染成藍紫色，而分生孢子呈白色(圖2C)。分生孢子針狀，大小為(22.4～52.0) μm × (2.2～6.0) μm，平均為30.7 μm × 3.8 μm。在PDA培養(yǎng)基上生長38天后，菌落周圍長出白色菌絲，是病原菌分生孢子萌發(fā)形成的無性菌絲(圖2B)。

圖1 巢式PCR擴增植原體16S rRNA基因片段Fig.1 Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment of phytoplasmaA:中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病樣品總DNA進行巢式PCR擴增 Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment from genomic DNA extracted from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis. M: DL2000 marker; 1—5: 感病中華業(yè)平竹Infected S.sinica; 6: 健康中華業(yè)平竹 Healthy S. sinica; 8—12: 感病巴山木竹Infected B. fargesii; 13: 健康巴山木竹Healthy B. fargesii; 15—19: 感病薄籜茶竿竹Infected P. amabilis var. tenuis; 20: 健康薄籜茶竿竹 Healthy P. amabilis var. tenuis; 7,14,21: 感病泡桐 Infected Paulownia. B:牡竹和黃麻竹叢枝病樣品總DNA進行PCR擴增的電泳Nested PCR amplification of 16S rRNA gene fragment from genomic DNA extracted from D. stenoaurita and D. strictus. M: DL2000 marker; 1—5: 感病牡竹Infected D. strictus; 6: 健康牡竹Healthy D. strictus; 8: 感病黃麻竹Infected D. stenoaurita; 9: 健康黃麻竹Healthy D. stenoaurita; 7,10: 感病泡桐Infected Paulownia.

圖2 5種竹子叢枝病病原菌的形態(tài)結構和培養(yǎng)性狀Fig.2 The morphological features and culture characteristics of the pathogens causing witches’broom disease of 5 bamboo speciesA—C：感病中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹上分離的病原菌分生孢子(A和C)及菌絲(B)The mycelia (B) and conidia (A and C) of the pathogen isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis. D—F：感病黃麻竹和牡竹上分離病原菌的菌絲(D和E)及分生孢子(F)The mycelia (D and E) and conidia (F) of the pathogen isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

采用組織分離法，從黃麻竹和牡竹叢枝病組織中分離到11株病原菌。這些病原菌菌絲具有相似的形態(tài)結構和培養(yǎng)性狀，其在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落正面為白色，背面為淺黃色。菌落呈圓形，表面平整，邊緣整齊(圖2D、E)。菌絲生長速度較慢，培養(yǎng)35天時菌落平均直徑僅為(2.70±0.77) cm。在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)72天后產(chǎn)生短棒狀分子孢子略有彎曲，大小為(5.4～10.5) μm ×(1.2～2.8) μm，平均為7.4 μm × 1.8 μm(圖2F)。

2.3 5種感病竹子原菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 病原菌LSU rDNA序列的PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育分析 以5種竹子叢枝病病原菌的總DNA為模板，采用引物對LR0R/LR5進行PCR擴增，分離的23個菌株中22個都能夠擴增出特異性條帶(圖3)，且擴增的條帶約為900 bp，與預期的條帶大小和竹針孢座囊菌標準菌株的條帶大小一致(圖3，泳道13)。擴增出的PCR產(chǎn)物進行純化、測序和序列分析，得到中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病病原菌12個菌株一致的892 bp序列(GenBank登錄號： MK691594)，該序列為病原菌的LSU rDNA D1—D2區(qū)域片段。而牡竹和黃麻竹叢枝病病原菌的11個菌株，測序得到一致的909 bp LSU rDNA D1—D2區(qū)域片段(GenBank登錄號： MK691595)。序列比對發(fā)現(xiàn)，2種病原菌的LSU rDNA D1—D2之間有42個脫氧核苷酸的差異，同源性為95.25%。

將測序結果用在線NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得與竹子叢枝病病原菌LSU rDNA具有很高相似性的麥角菌科真菌序列。使用MEGA 6.0 進行序列比對，刪除兩端不整齊的序列，鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定麥角菌科真菌間的親緣關系。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可以看出，分離自中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹的叢枝病病原菌與麥角菌屬(Claviceps)數(shù)個菌株聚為一支，支持率為82%，親緣關系很近；而分離自牡竹和黃麻竹的叢枝病病原菌與肉瘤座菌屬(Balansia)數(shù)個菌株聚為一支，支持率為58%，親緣關系很近。

圖3 5種竹子叢枝病病原菌LSU rDNA的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of LSU rDNA fragment from genomic DNA extracted from the pathogens causing witches’ broom disease of 5 bamboo speciesM: DL2000 marker; 1—12: 中華葉平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹分離的12株病原菌The pathogen strains isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis; 13: 竹針孢座囊菌標準菌株Aciculosporium take; 14—24: 牡竹和黃麻竹叢枝病病原菌的11個菌株The pathogen strains isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

圖4 基于LSU rDNA序列構建的麥角菌科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree inferred from the neighbor-joining (NJ) analysis based on the LSU rDNA dataset

2.3.2 病原菌ITS rDNA序列的PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育分析 采用引物對ITS1F/ITS4對5種竹子叢枝病病原菌的總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，分離的23個菌株都能夠擴增出特異性條帶，預期的條帶大小約700 bp(圖5)。擴增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測序和序列分析，得到中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病病原菌12個菌株的536 bp序列(GenBank登錄號： MK874908)，所有12個菌株536 bp序列的同源性為100%，屬同一物種，該序列包括18S rDNA的57 bp序列、ITS1的141 bp序列、5.8S rDNA的157 bp序列、ITS2的164 bp序列和28S rDNA的17 bp序列。而牡竹和黃麻竹叢枝病病原菌的11個菌株獲得538 bp序列(GenBank登錄號： MK874907)，所有11個菌株538 bp序列的同源性為100%，屬同一物種，該序列包括18S rDNA的58 bp序列、ITS1的137 bp序列、5.8S rDNA的157 bp序列和ITS2的186 bp序列。序列比對發(fā)現(xiàn)，2種病原菌的ITS1 + ITS2序列間有96個脫氧核苷酸的差異，同源性為70.73%； 而2種病原菌的5.8S rDNA序列具有高度保守性，其長度一致，僅有6個脫氧核苷酸的差異，同源性為96.18%。

將測序結果用在線的NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得與竹子叢枝病病原菌ITS rDNA具有很高相似性的麥角菌科真菌序列。使用MEGA 6.0 進行序列比對，刪除兩端不整齊的序列，鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定麥角菌科真菌間的親緣關系。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)可以看出，分離自中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病病原菌與竹針孢座囊菌聚為一支，支持率為99%，故該病原菌為竹針孢座囊菌；而分離自牡竹和黃麻竹叢枝病病原菌與箣竹異香柱菌(Heteroepichlo?bambusae)聚為一支，支持率為100%，故該病原菌為箣竹異香柱菌。

圖5 5種竹子叢枝病病原菌ITS rDNA的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of ITS rDNA fragment from genomic DNA extracted from the pathogens causing witches’ broom disease of 5 bamboo speciesM: DL2000 marker; 1—12: 中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹分離的12株病原菌The pathogen strains isolated from S. sinica, B. fargesii and P. amabilis var. tenuis;13: 竹針孢座囊菌標準菌株A. take; 14—24: 牡竹和黃麻竹叢枝病病原菌的11個菌株The pathogen strains isolated from D. stenoaurita and D. strictus.

圖6 基于ITS rDNA序列構建的麥角菌科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree inferred from the neighbor-joining (NJ) analysis based on the ITS rDNA dataset

3 討論

竹子叢枝病是竹類植物上的一種重要病害，早期研究者認為只發(fā)生于剛竹屬，后來，在非剛竹屬的倭竹屬、業(yè)平竹屬、苦竹屬、赤竹屬、巴山木竹屬、牡竹屬竹種上也發(fā)現(xiàn)叢枝病，表明叢枝病是一種非常普遍的竹子病害(Tsudaetal.， 1997; Yadavetal.， 2016; 程燕林等, 2009; 耿顯勝等, 2017a)。本研究采集的5種竹子樣品是剛竹屬以外的5個屬，其中綠竹屬(Dendrocalamopsis)為首次報道發(fā)生叢枝病的屬。對5種竹子叢枝病樣品提取總DNA，使用植原體特異性引物進行巢式PCR擴增，未檢測出植原體，表明本研究5種竹子叢枝病不是由植原體引起的。在印度，Suryanarayana等(2009)和Yadav等(2016)使用巢式PCR法從感病牡竹中檢測到植原體，而本研究采集于中國云南省的感病牡竹其病原菌卻不是植原體。

采用組織分離法分離竹子叢枝病病原菌，在浙江省采集的中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹感病樣品中分離到12個菌株，菌株的菌絲和分生孢子與竹針孢座囊菌標準菌株一致； 在云南省采集的牡竹和黃麻竹分離到11個菌株，在顯微鏡下可觀察到白色的菌絲和短棒狀的分生孢子，其形態(tài)結構與竹針孢座囊菌標準菌株不同，表明牡竹和黃麻叢枝病病原菌非竹針孢座囊菌。

病原菌ITS rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹感病樣品12個菌株的536 bp序列一致，表明該病原菌的ITS rDNA序列具有很高的保守性；基于ITS rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該病原菌與竹針孢座囊菌聚為同一支，進一步證明中華業(yè)平竹、巴山木竹和薄籜茶竿竹叢枝病病原菌為竹針孢座囊菌。早在1988年，我國學者就從感病的槽里黃剛竹(Phyllostachysviridis)和淡竹(Phyllostachysglauca)樣品上分離到竹針孢座囊菌(朱煕樵等， 1988)，當時該菌被歸類為肉瘤座菌屬(Balansia)的竹瘤座菌(Balansiatake)；其后的分子分類數(shù)據(jù)表明，該菌與肉瘤座菌屬的親緣關系遠，而與麥角菌屬的親緣關系近，《真菌詞典》第10版將該菌歸類為竹針孢座囊菌屬竹針孢座囊菌，目前中英文文獻均采用竹針孢座囊菌這一種名。牡竹和黃麻竹感病樣品11個菌株的ITS rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析得到一致的538 bp序列，該序列與箣竹異香柱菌聚為一支，表明該病原菌為箣竹異香柱菌。病原菌LSU rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明， 竹針孢座囊菌與麥角菌屬的親緣關系最近，與Tanaka 等(2008)基于ALDH1-1序列確定的系統(tǒng)發(fā)育關系一致； 箣竹異香柱菌與肉瘤座菌屬的親緣關系最近，而與香柱菌屬(Epichlo?)的親緣關系較遠，與Tanaka等(2002)的研究結果一致。

4 結論

本研究采用組織分離法分離到非剛竹屬5種竹子叢枝病病原菌，并結合依據(jù)病源菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，形態(tài)學和分子生物學方法對病原菌進行物種鑒定，并對病原菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明， 巴山木竹、薄籜茶竿竹和中華業(yè)平竹叢枝病病原菌為竹針孢座囊菌，黃麻竹和牡竹叢枝病病原菌為箣竹異香柱菌。竹針孢座囊菌與麥角菌屬的親緣關系最近，箣竹異香柱菌與肉瘤座菌屬的親緣關系最近，與香柱菌屬的親緣關系較遠。本研究首次在綠竹屬竹種上發(fā)現(xiàn)叢枝病，研究結果可為竹子叢枝病病原菌的鑒定、殺菌劑的篩選和病害的科學防控提供基礎，同時對于麥角菌科菌種間親緣關系的確定也具有重要意義。